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關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管、淋巴管、神經(jīng)和干細(xì)胞，因此在受損后無(wú)法進(jìn)行自我修復(fù)。傳統(tǒng)治療方法可以在一定程度上恢復(fù)關(guān)節(jié)軟骨功能，但其治療效果往往不盡如人意。軟骨組織工程為解決關(guān)節(jié)軟骨缺陷提供了一有前景的解決方案。然而，該領(lǐng)域仍面臨諸多挑戰(zhàn)，包括需要結(jié)構(gòu)仿生、快速個(gè)性化定制和原位誘導(dǎo)軟骨組織再生，這些問(wèn)題阻礙了其向臨床實(shí)踐的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。關(guān)節(jié)軟骨由透明軟骨、鈣化軟骨和軟骨下骨三層組成，每一層都具有獨(dú)特的細(xì)胞外基質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)組織和細(xì)胞密度。這種復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了物理、機(jī)械和生物特性的梯度，這些梯度對(duì)骨軟骨（OC）缺陷的修復(fù)有著重要影響。因此，創(chuàng)造有利于軟骨和骨組織再生的微環(huán)境對(duì)于推進(jìn)軟骨組織工程策略和在骨軟骨缺損治療中取得積極成果至關(guān)重要。

針對(duì)上述問(wèn)題和挑戰(zhàn)，蘭州大學(xué)范增杰教授課題組通過(guò)3D打印技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種可快速定制、具有干細(xì)胞捕獲和歸巢能力的仿生軟骨支架，該支架由三種預(yù)先設(shè)計(jì)的生物墨水模塊單元組成，每個(gè)模塊單元發(fā)揮具有不同的功能。如圖1所示，所制備的打印支架不僅準(zhǔn)確再現(xiàn)了關(guān)節(jié)軟骨組織的三層結(jié)構(gòu)和材料梯度，還具有良好的獲抗壓強(qiáng)度(6.3 MPa)。對(duì)于該仿生支架的底層墨水模塊單元，使用適體HM69通過(guò)SA的羧基與HM69的胺基之間的酰胺化反應(yīng)對(duì)SA進(jìn)行修飾；此外，還引入了70%KH570改性的HANFs。在中間層模塊化單元中，沒(méi)有對(duì)水凝膠基底進(jìn)行改性，而是引入了40%的KH570改性HANFs。至于頂層，將裝有 SDF-1α 的 PLGA 納米顆粒封裝入水凝膠基底，沒(méi)有添加任何 KH570 改性的 HANFs。該支架在其底層和頂層集成了干細(xì)胞捕獲層和歸巢層。這種設(shè)計(jì)能夠通過(guò)適體相互作用在體內(nèi)特異性捕獲骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，然后通過(guò)SDF-1α濃度梯度的趨化性將其動(dòng)員到透明軟骨層上。在支架的微環(huán)境中，這些骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在每一層分化為不同的細(xì)胞，有效地促進(jìn)了關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)。

圖1 仿生軟骨支架生物墨水模塊單元組成和制造工藝示意圖

（1）仿生軟骨支架的物理化學(xué)、形態(tài)和機(jī)械特性

圖2 物理化學(xué)、形態(tài)和機(jī)械性能表征

圖2A-D中的結(jié)果表明制備仿生軟骨支架所用材料的成功合成。對(duì)于打印出來(lái)的支架(圖2E)，其SEM呈現(xiàn)出明顯的三層結(jié)構(gòu)，如在上層，可以清晰地觀察到PLGA納米球尺寸分布均勻。而在中下層，也可以清晰地觀察到同質(zhì)的HANFs。由于HANFs的增強(qiáng)作用以及其與PAM水凝膠的化學(xué)交聯(lián)作用，打印的支架具有較高的形狀保持能力和優(yōu)異的力學(xué)性能。即使在折疊和卷曲狀態(tài)下，它們?nèi)匀豢梢员３纸Y(jié)構(gòu)的完整性(圖2F)。應(yīng)力應(yīng)變?cè)囼?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了其優(yōu)異的力學(xué)性能(圖2G,H)。研究者認(rèn)為HANFs在改善機(jī)械支柱方面發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用。

（2）仿生軟骨支架對(duì)BMSCs的招募能力

干細(xì)胞捕獲是原位誘導(dǎo)再生的第一步。在體外實(shí)驗(yàn)組研究人員將BMSCs種在Transwell孔板的上室，而具有招募能力的打印支架則放置在Transwell孔板的下室。結(jié)果表明，經(jīng)SDF-1α包封的HM69和PLGA納米球功能化后的打印支架（如GS69組）在培養(yǎng)24 h后表現(xiàn)出比其他支架更高的招募能力（圖3A）。此外，研究者評(píng)估了打印支架在體內(nèi)BMSCs的募集情況。用免疫熒光染色特異性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44來(lái)量化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢能力。結(jié)果表明，在HM69和SDF-1α功能化的打印支架上培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD44和F-actin的陽(yáng)性表達(dá)量較高，尤其是GS69和HS69組。這證實(shí)了HM69和SDF-1的功能化修飾是誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)歸巢和遷移的有效方法(圖3B)。

圖3 體內(nèi)BMSCs的招募能力和體外BMSCs的招募能力

（3）仿生軟骨支架的生物相容性

圖4 打印支架上培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活/死染色、Phalloidin/Hoechst染色、EdU染色

良好的細(xì)胞相容性是保證合成材料在體內(nèi)安全使用的必要條件。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同支架上培養(yǎng)1、3、5、7天，與對(duì)照組相比差異不顯著，說(shuō)明所有支架均具有良好的細(xì)胞相容性（圖4A）。此外，Phalloidin/Hoechst染色觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，不同支架上培養(yǎng)的細(xì)胞均呈現(xiàn)清晰的細(xì)胞骨架形態(tài)和正常的擴(kuò)散狀態(tài)(圖4B)。最后，EdU摻入實(shí)驗(yàn)研究了支架對(duì)BMSCs體外增殖能力的影響。結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h后，GS69組與陰性對(duì)照組的細(xì)胞增殖數(shù)量無(wú)顯著差異，說(shuō)明該組對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)不良影響。

（4）打印支架對(duì)兔OC缺陷模型的體內(nèi)修復(fù)效果

圖5 打印支架對(duì)兔OC缺陷模型的體內(nèi)修復(fù)效果

通過(guò)術(shù)后6周的觀察，GS69組在軟骨缺損區(qū)域形成了完整且平滑的軟組織，相比之下，其他組只顯示出部分軟組織修復(fù)(圖5Aa)。術(shù)后12周，對(duì)照組、H組、G組、HS組和H69組的修復(fù)仍被抑制，缺損表面有不規(guī)則軟組織覆蓋。具有BMSCs募集功能的支架組(如GS、G69、GS69)缺損區(qū)顯示完整光滑的軟骨樣組織覆蓋，而HS69組由于缺乏HANFs支持，仍有部分塌陷(圖5Ab)。此外，研究者通過(guò)微型計(jì)算機(jī)斷層掃描（Micro-CT）分析進(jìn)一步證實(shí)了GS69支架在6周和12周時(shí)對(duì)原位誘導(dǎo)的OC缺陷再生有顯著的積極作用，而其他組的修復(fù)效果不明顯（圖5Ac-Af）。對(duì)缺損內(nèi)新形成骨的定量評(píng)估證實(shí)了上述觀察結(jié)果（圖5B）。梯度水凝膠支架組感興趣小梁體積的骨體積/總體積(BV/TV)值明顯高于對(duì)照組，這表明將HANFs加入水凝膠增強(qiáng)了骨的再生能力，使構(gòu)建物與宿主骨之間形成緊密結(jié)合。國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)（ICRS）宏觀評(píng)估也顯示（圖5C和5D），對(duì)照組第12周的ICRS平均評(píng)分≈7.00±0.82，屬于III級(jí)(異常)。相比之下，GS69組處理動(dòng)物的ICRS平均評(píng)分為≈11.33±0.47，評(píng)分為II級(jí)(接近正常軟骨)。這些結(jié)果表明，GS69支架對(duì)兔子的骨軟骨缺損具有顯著的體內(nèi)修復(fù)效果。

（5）修復(fù)軟骨的組織學(xué)分析

圖6 修復(fù)軟骨的組織學(xué)分析

染色結(jié)果顯示，6周時(shí)，對(duì)照組缺損區(qū)纖維有限，組織修復(fù)不成熟。12周時(shí)，缺損區(qū)有連續(xù)的組織，有少量軟骨細(xì)胞和更多的纖維組織。與其他組相比，GS69組軟骨缺損下面板在6周時(shí)填充了未降解的支架。12周時(shí)，軟骨再生成功，組織形態(tài)與正常透明軟骨相似。再生軟骨與周圍軟骨融合良好，軟骨下骨生長(zhǎng)良好。此外，O’driscoll組織學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示，GS69組的評(píng)分最高(第6周≈19.67±1.70;第12周≈26.67±0.47)?？傮w而言，組織學(xué)評(píng)價(jià)進(jìn)一步證實(shí)了GS69支架促進(jìn)軟骨再生的有效性。

（6）修復(fù)軟骨的免疫熒光分析

圖7 修復(fù)軟骨的免疫熒光

免疫熒光分析結(jié)果顯示，6周時(shí)，GS69組的ACAN和COL2A1陽(yáng)性細(xì)胞率顯著高于其他各組，COL1和RUNX2陽(yáng)性細(xì)胞率接近含HANFs組(圖7B、C)。隨著修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)至12周，GS69組中ACAN、COL2A、COL1、RUNX2陽(yáng)性細(xì)胞比例增加。多數(shù)軟骨細(xì)胞分布形態(tài)規(guī)則，伴有ACAN和II型膠原細(xì)胞外基質(zhì)染色。COL1和RUNX2的高表達(dá)可以證實(shí)骨髓腔附近有新骨形成。這些結(jié)果表明，單獨(dú)釋放SDF-1α對(duì)誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化的作用并不像之前其他研究顯示的那樣顯著，因此也提示促進(jìn)干細(xì)胞分化的主要原因在于支架的力學(xué)性能和微環(huán)境的相互協(xié)調(diào)。

小結(jié)：

該研究提出了軟骨組織工程領(lǐng)域的幾項(xiàng)重大創(chuàng)新。打印的支架不僅準(zhǔn)確地再現(xiàn)了關(guān)節(jié)軟骨組織的三層結(jié)構(gòu)和材料梯度，而且通過(guò)羥基磷灰石納米纖維的增強(qiáng)和與水凝膠的化學(xué)鍵的建立，獲得了良好的抗壓強(qiáng)度。支架的復(fù)雜設(shè)計(jì)，提供了一種獨(dú)特而有效的方法來(lái)捕獲和動(dòng)員骨髓腔內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞到損傷部位。該方法是后續(xù)干細(xì)胞粘附、增殖和分化的基本前提。此外，支架的仿生設(shè)計(jì)結(jié)合了材料和結(jié)構(gòu)梯度模擬，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在每層內(nèi)分化成不同的細(xì)胞類型建立了理想的微環(huán)境。因此，這種方法允許定制受損的關(guān)節(jié)軟骨組織，并通過(guò)利用3D打印技術(shù)高效生產(chǎn)支架。通過(guò)在單個(gè)支架內(nèi)合并多種功能，可以立即植入受損軟骨部位，從而避免了體外干細(xì)胞共培養(yǎng)的需要。因此，一步式3D打印仿生軟骨支架可立即植入并原位誘導(dǎo)骨軟骨再生，這在骨軟骨修復(fù)中具有廣泛應(yīng)用的巨大潛力。

相關(guān)工作以“Rapid Customization of Biomimetic Cartilage Scaffold with

Stem Cell Capturing and Homing Capabilities for In Situ Inductive Regeneration of Osteochondral Defects”為題于2024年6月1日發(fā)表在《Advanced Functional Materials》上。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1002/adfm.202400608