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研究背景：

糖尿病已經(jīng)成為全球十大慢性代謝疾病中的第一種，還會引起許多的并發(fā)癥。糖尿病傷口微環(huán)境破壞了正常的傷口愈合階段，高血糖環(huán)境會產(chǎn)生高濃度的活性氧（ROS），導(dǎo)致持續(xù)性炎癥，進一步促進巨噬細胞極化為M1表型，從而加劇病情。在臨床實踐中，高血糖和巨噬細胞極化被認為是治療糖尿病傷口的突破口。細菌感染是導(dǎo)致糖尿病傷口愈合緩慢的另一個關(guān)鍵因素，而傷口部位pH值與細菌感染有關(guān)，因此，監(jiān)測傷口的pH值可以明確傷口狀態(tài)，為治療提供早期預(yù)警。光熱抗菌是一種有望替代抗生素治療的治療方式，光熱劑將光能轉(zhuǎn)化為熱能，破壞細菌的細胞膜和蛋白質(zhì)，達到消除細菌的目的，其副作用小、可控性強、避免細菌耐藥性。

針對上述問題，武漢理工大學(xué)戴紅蓮教授團隊設(shè)計了一種集合診斷和治療功能的水凝膠，用于監(jiān)測傷口部位pH值的變化，結(jié)合ROS清除和光熱抗菌，調(diào)節(jié)糖尿病傷口微環(huán)境，促進糖尿病傷口愈合。首先，采用水熱法制備了氧化鈰復(fù)合二硫化鉬納米顆粒（C@M），并在C@M上沉積一層聚多巴胺（C@M@P）。隨后，通過硫辛酸改性殼聚糖（LAMC），在紫外線（UV）下凝膠化。最后，將碳量子點（CD）和C@M@P摻入LAMC水凝膠中，在pH值4-9的范圍內(nèi)實現(xiàn)熒光響應(yīng)，使用智能手機監(jiān)測水凝膠的熒光信號，測量RGB值，產(chǎn)生擬合曲線，實時監(jiān)測傷口部位的pH值。相關(guān)研究在2024年4月21日以“A Multifunctional Hydrogel with Photothermal Antibacterial and AntiOxidant Activity for Smart Monitoring and Promotion of Diabetic Wound Healing”為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202402531）上。

設(shè)計示意圖

（1） 復(fù)合水凝膠的智能pH監(jiān)測能力

正常皮膚的pH值在5-6之間，而糖尿病傷口可以在堿性條件下維持數(shù)月，這會導(dǎo)致嚴重的炎癥和細菌感染，延長傷口愈合時間。在紫外光（365 nm）下，水凝膠的熒光強度隨pH值的變化而變化（圖1A）。當pH值逐漸增大時，熒光強度也逐漸增強，且熒光強度與pH值的線性曲線可以很好的擬合，可以得出熒光強度與pH值的線性方程，這有助于實時監(jiān)測傷口狀態(tài)。為了解決肉眼下熒光強度變化的區(qū)別，使用智能手機將圖像轉(zhuǎn)換為RGB信號，構(gòu)建pH值與RGB的關(guān)系方程，通過擬合發(fā)現(xiàn)pH=0.1328（G+B）-41.66，利用這一方程可輕松獲取傷口pH值。

圖1 水凝膠的智能pH監(jiān)測功能

（2）復(fù)合水凝膠的物理性質(zhì)和ROS清除能力

通過搭接剪切強度實驗測量復(fù)合水凝膠的黏附強度，隨著C@M@P NPs的添加，黏附強度增大，且抗壓強度得到顯著提高。此外，加入C@M@P NPs后，水凝膠表現(xiàn)出更快的溶脹動力學(xué)，溶脹性得到提高。利用ROS清除實驗評估復(fù)合水凝膠對H2O2、·OH、和O2-的清除效果，結(jié)果顯示，LAMC水凝膠具有一定的清除能力，主要是由于硫辛酸的抗氧化特性。摻入C@M@P NPs后，水凝膠的ROS清除能力得到進一步提高，主要原因是與CeO2表面的氧空位有關(guān)。綜上，復(fù)合水凝膠具有良好的ROS清除活性，具有減輕氧化應(yīng)激損傷的潛力。

圖2 復(fù)合水凝膠的物理性質(zhì)和ROS清除能力

（3）光熱性能與近紅外輔助抗菌性能

為了評估復(fù)合水凝膠的光熱效應(yīng)，使用808 nm近紅外激光照射水凝膠，記錄溫度與時間變化曲線。LAMC水凝膠經(jīng)過10 min照射后，溫度升高不明顯，加入C@M@P NPs和CD后，LAMC/CD-C@M@P水凝膠的溫度升高至62.3℃。通過平板計數(shù)法評估復(fù)合水凝膠的抗菌性能，LAMC水凝膠對E. coli和S. aureus的抑制率僅有17.71%±6.48%和25.83%±0.73%，主要是由于帶正電荷的殼聚糖吸引帶負電的細菌，破壞細菌膜的滲透性。加入C@M@P NPs和CD，并通過NIR照射后，對E. coli和S. aureus的抑制率接近100%。隨后通過SEM觀察細菌形態(tài)，對照組細菌保持光滑且呈完整的球形或棒狀，LAMC/CD-C@M@P水凝膠通過NIR照射后，細菌細胞膜受損嚴重，內(nèi)容物流出。因此，C@M@P NPs的光熱效應(yīng)在抗菌中起到關(guān)鍵作用。

圖3 復(fù)合水凝膠的光熱和抗菌性能

（4）生物相容性和細胞遷移

良好的生物相容性是臨床生物材料的基本要求。在第1天和第3天沒有觀察到明顯的細胞毒性，到第5天LAMC/CD-C@M@P水凝膠與對照組開始出現(xiàn)差異，這是由于水凝膠中NPs的釋放所致，但是對L929細胞的存活率均超過95%，細胞活死染色也證明了這一點。通過細胞劃痕實驗評估水凝膠對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）遷移的影響，LAMC水凝膠基本與對照組接近，而LAMC/CD-C@M@P水凝膠明顯促進了HUVEC的遷移，定量統(tǒng)計也顯示，LAMC/CD-C@M@P水凝膠處理24 h后細胞劃痕覆蓋率達到65.24%±1.13%。這些結(jié)果表明LAMC/CD-C@M@P水凝膠可以促進細胞遷移。

圖4 復(fù)合水凝膠的體外細胞相容性和細胞遷移

（5） 抗氧化和抗炎能力

使用H2O2處理過的L929細胞作為氧化應(yīng)激模型，使用DCFH-DA探針研究復(fù)合水凝膠在細胞水平上的抗氧化能力。結(jié)果顯示，對照組的熒光強度為72.37%±7.00%，LAMC水凝膠和LAMC/CD-C@M@P水凝膠的熒光強度降低至54.56%±3.88%和30.41%±4.25%，表明LAMC/CD-C@M@P水凝膠可以有效的防止L929細胞的氧化應(yīng)激。隨后，通過LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞M1/M2表型相關(guān)基因的表達評價復(fù)合水凝膠的抗炎活性。結(jié)果顯示，LPS刺激后，M1相關(guān)基因（IL-1β、iNOS和IL-10）急劇增加，LAMC/CD-C@M@P水凝膠顯著抑制了IL-1β、iNOS和IL-10的表達，促進了與M2相關(guān)基因（Arg-1、TGF-β和IL-10）的表達，表現(xiàn)出良好的抗炎活性。

圖5 復(fù)合水凝膠的抗氧化和抗炎作用

（6）體內(nèi)pH監(jiān)測與傷口愈合

通過腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）構(gòu)建大鼠糖尿病模型，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建糖尿病感染傷口模型。為了實現(xiàn)實時監(jiān)測和治療系統(tǒng)，使用LAMC/CD-C@M@P水凝膠監(jiān)測0-3天的pH值變化，通過記錄熒光強度的變化，并根據(jù)公式計算實時pH值。通過NIR照射后，第3天的傷口pH值基本恢復(fù)，這意味著有效消除了S. aureus并緩解了細菌感染。在實時監(jiān)測過程中，使用pH計真實記錄傷口的pH值變化，結(jié)果顯示與監(jiān)測值具有很強的相關(guān)性（圖6D）。在第14天LAMC/CD-C@M@P水凝膠的傷口愈合率達到94.73%±3.22%，明顯優(yōu)于對照組。

圖6 復(fù)合水凝膠在糖尿病傷口中的體內(nèi)研究

（7） 組織學(xué)與免疫熒光分析

通過免疫熒光染色和組織學(xué)分析評估LAMC/CD-C@M@P水凝膠的組織再生能力。LAMC/CD-C@M@P水凝膠組顯示出較少的炎癥細胞以及較高程度的傷口閉合，還顯示出更多的膠原沉積量，結(jié)果表明LAMC/CD-C@M@P水凝膠可有效促進傷口愈合和膠原蛋白沉積。通過IL-6和CD31的免疫熒光染色評估傷口修復(fù)情況。LAMC/CD-C@M@P水凝膠組IL-6表達最低，表明驗證反應(yīng)減少，CD31表達量最高，表明血管生成最多。此外，CD86和CD206的免疫熒光染色結(jié)果表明，LAMC/CD-C@M@P水凝膠可以促進巨噬細胞分化為M2表型，表現(xiàn)出抗炎作用。

圖7 傷口的組織學(xué)分析

圖8 傷口的免疫熒光染色

小結(jié)：

該團隊設(shè)計了一種具有pH監(jiān)測、光熱抗菌、抗氧化和抗炎特性的新型診斷和治療水凝膠。將CD摻入LAMC水凝膠賦予水凝膠光致發(fā)光性能，其熒光強度根據(jù)pH值的變化而變化。將C@M@P摻入LAMC水凝膠使水凝膠表現(xiàn)出良好的壓縮強度、光熱轉(zhuǎn)換能力和近紅外輔助抗菌能力。此外，LAMC/CD-C@M@P水凝膠還能有效清除ROS，緩解炎癥反應(yīng)，促進巨噬細胞M2表型轉(zhuǎn)化，促進糖尿病傷口愈合。因此，本研究為糖尿病傷口提供了一種新的監(jiān)測與治療多合一的策略。

原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202402531