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針對(duì)上述問(wèn)題，北京大學(xué)劉燕、王存玉、中國(guó)科學(xué)院羅聃以及華中科技大學(xué)龔士強(qiáng)團(tuán)隊(duì)受生物礦化啟發(fā)，在M2型巨噬細(xì)胞來(lái)源的小細(xì)胞外囊泡（M2EV）表面原位生長(zhǎng)磷酸鈣納米晶體，構(gòu)建M2EV@CaP納米雜合體；該礦化層既充當(dāng)物理屏障，顯著提升囊泡儲(chǔ)存、抗降解與循環(huán)穩(wěn)定性，又提供鈣磷離子庫(kù)，可在炎癥酸性微環(huán)境智能釋放，協(xié)同M2EV的免疫調(diào)節(jié)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)“抗炎-促骨”雙重增效。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在高糖炎癥條件下能顯著抑制M1極化、促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化；進(jìn)一步將M2EV@CaP載入水凝膠，用于糖尿病大鼠顱骨缺損，獲得明顯優(yōu)于天然M2EV的骨再生療效，為糖尿病骨缺損治療提供了穩(wěn)定、高效、可轉(zhuǎn)化的新方案。該文章于2025年10月1日以《Calcium Phosphate Nanoparticle-Immobilized Macrophage-Derived Extracellular Vesicle Nanohybrid Facilitates Diabetic Bone Regeneration》為題發(fā)表于《Advanced Materials》上（DOI: 10.1002/adma.202509410）。

研究示意圖

（1）M2EV@CaP的制備和表征

首先圖1a 給出整體流程示意圖：M2EV 在富鈣 DMEM 中通過(guò)靜電吸附觸發(fā)原位礦化。隨后圖1b 的 TEM 顯示，2 h 時(shí)囊泡仍保持典型杯狀輪廓但表面明顯粗糙；延長(zhǎng)至 4 h 則因過(guò)度沉積出現(xiàn)聚集，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一采用 2 h 方案。圖1c 的 EDS 元素映射進(jìn)一步驗(yàn)證，Ca、P、O 在囊泡表面均勻共存，Ca/P 原子比≈1:1，確證 CaP 殼層形成。與此對(duì)應(yīng)，圖1d 的 DLS 測(cè)得粒徑由 130.6 ± 8.8 nm 增至 197.5 ± 13.2 nm；圖1e 的 AFM 力曲線表明彈性模量從 1.85 GPa 躍升至 4.35 GPa，提示機(jī)械穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。圖1f 的 Zeta 電位由 ?23.8 mV 升至 ?20.4 mV，反映表面電荷因礦化而改變。圖1g 的 FTIR 在 500–600 與 1000–1100 cm?1 出現(xiàn) P–O 振動(dòng)峰，同時(shí)保留 1500–1600 cm?1 的 C–O 峰，TGA 測(cè)得有機(jī)質(zhì)占比約 30%，共同證明有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化結(jié)構(gòu)。為評(píng)估儲(chǔ)存穩(wěn)定性，圖1h–k 將樣品于 4 °C 放置 7 d：TEM 顯示 M2EV 膜破裂并聚集，DLS 出現(xiàn) <100 nm 與 >1000 nm 雙峰，平均粒徑增至 241.2 ± 42.6 nm，且 EV 標(biāo)志蛋白表達(dá)下降；而 M2EV@CaP 仍呈完整球形，粒徑僅輕微增至 216.2 ± 15.6 nm，Alix、TSG101、CD63、CD9 水平與新鮮樣品相當(dāng)，表明礦化殼有效抑制降解。最后，圖1l–n 在 pH 6.0、37 °C 條件下模擬酸觸發(fā)：TEM 顯示 16 h 礦化殼幾乎完全消失，DLS 粒徑回降至 117.0 ± 7.7 nm；鈣離子釋放曲線表明 4 h 內(nèi)釋放率 >90%，而中性 pH 下不足 10%，從而證實(shí) M2EV@CaP 具備優(yōu)異的儲(chǔ)存穩(wěn)定性與酸響應(yīng)控釋性能。

圖1. M2EV@CaP的制備和表征。a）M2EV@CaP的合成過(guò)程的示意圖；;b）M2EV（陰性染色）和M2EV@CaP（未染色）的代表性TEM圖像；c）M2EV@CaP的元素圖譜分析； d）顯示M2EV和M2EV@CaP的粒度分布（左）和平均直徑（右）的DLS；E)M2EV和M2EV@CaP的楊氏模量圖和半定量比較；f）M2EV和M2EV@CaP的Zeta電位；g）CaP和M2EV@CaP的FTIR光譜; h）用于評(píng)估M2EV@CaP的穩(wěn)定性和pH響應(yīng)性釋放行為的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖；i) 在4 ℃下儲(chǔ)存一周之前和之后的M2EV（負(fù)染色）和M2EV@CaP（未染色）的代表性TEM圖像；j）在4 ℃下儲(chǔ)存一周之前和之后M2EV（上）和M2EV@CaP（下）的DLS曲線和平均粒度；k)細(xì)胞外囊泡標(biāo)記蛋白的表達(dá)水平；I)在pH 6.0的PBS中孵育不同時(shí)間點(diǎn)的M2EV@CaP的代表性TEM圖像。m）不同pH條件下M2EV@CaP的粒度分布（左）和平均直徑（右）的DLS分析；n）在不同pH值下M2EV@CaP在PBS中的累積Ca2+釋放曲線

（2）M2EV@CaP的生物相容性和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)

圖2a的活/死熒光圖像顯示各組幾乎全為綠色活細(xì)胞，定量存活率>95%，表明M2EV@CaP無(wú)急性毒性；圖2b的CCK-8曲線呈時(shí)間依賴性上升，7天時(shí)與Control、M2EV差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，確認(rèn)長(zhǎng)期增殖活性不受抑制；圖2c的共定位分析表明PKH26信號(hào)與Lyso-Tracker高度重疊，與Mito-Tracker極少重疊。證實(shí)溶酶體為主要轉(zhuǎn)運(yùn)終點(diǎn)且呈時(shí)間依賴性成熟；圖2d的TEM低倍可見(jiàn)多處質(zhì)膜內(nèi)陷（白色箭頭），高倍確認(rèn)內(nèi)含電子致密球體（藍(lán)色箭頭），提示網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞是主要入口；圖2e的EDS面掃顯示胞質(zhì)黑色顆粒Ca、P、O原子比約1:1:4，與無(wú)定型磷酸鈣特征譜一致，且顆粒周圍可見(jiàn)膠原纖維沉積，預(yù)示早期生物礦化。綜上，M2EV@CaP兼具良好生物相容性與溶酶體依賴的酸響應(yīng)降解能力，在釋放囊泡內(nèi)容物的同時(shí)誘導(dǎo)礦化顆粒形成，為其后續(xù)促成骨應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖2.M2EV@CaP的生物相容性和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。a）用不同組處理24小時(shí)后BMSC的代表性活/死染色圖像（左）（對(duì)照、M2 EV和M2EV@CaP）及相應(yīng)的半定量分析（右）。b）CCK-8測(cè)定，評(píng)估用各組處理后BMSC的增殖；c)用PKH 26標(biāo)記的M2EV@CaP或M2 EV（紅色）孵育6小時(shí)后BMSC的代表性熒光圖像；）d) M2EV@CaP在BMSC中的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的表性的TEM圖像；e）用M2EV@CaP處理的BMSC分泌的電子致密顆粒的高角度環(huán)形暗場(chǎng)掃描透射電子顯微鏡（HAADF-STEM）和元素圖譜

（3）M2EV@CaP高糖炎癥免疫調(diào)節(jié)與促成骨

圖3a示意HG+LPS模擬糖尿病炎癥環(huán)境，明確后續(xù)實(shí)驗(yàn)背景。圖3b RT-qPCR顯示，與單純HG+LPS刺激相比，M2EV與M2EV@CaP均顯著下調(diào)IL-6、CCL2、IL-1β mRNA水平，兩組間轉(zhuǎn)錄差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示基礎(chǔ)抗炎基因表達(dá)趨勢(shì)一致。圖3c Western blot進(jìn)一步揭示，M2EV@CaP對(duì)NOS2、IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的抑制幅度明顯大于M2EV，表明礦化外殼在翻譯后水平增強(qiáng)抗炎效力。圖3d免疫熒光共標(biāo)NOS2/CD68顯示，M2EV@CaP組NOS2陽(yáng)性信號(hào)面積顯著縮小，半定量結(jié)果與Western趨勢(shì)吻合，直觀證實(shí)其更有效地阻斷M1表型。圖3e流程圖示意成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，突出炎癥-成骨雙重壓力。圖3f qPCR結(jié)果表明，M2EV@CaP處理7 d后BMP2、RUNX2、SP7 mRNA表達(dá)量約為對(duì)照的2.5–3倍，顯著優(yōu)于M2EV組，提示轉(zhuǎn)錄層面成骨程序被充分激活。圖3g Western blot顯示，對(duì)應(yīng)蛋白水平隨基因上調(diào)而同步升高，且礦化組增幅最大，說(shuō)明CaP殼協(xié)同EV信號(hào)放大成骨蛋白合成。圖3h ALP染色7 d呈深紫色，ARS染色14 d出現(xiàn)廣泛紅褐色鈣結(jié)節(jié)，積分光密度定量分別提高2.8倍與3.4倍，直觀反映M2EV@CaP在早期酶活與晚期礦化沉積的雙重優(yōu)勢(shì)。綜上，圖3a–3h共同證明M2EV@CaP在糖尿病樣炎癥環(huán)境中兼具抑制M1極化與強(qiáng)力促成骨的雙重功能。

圖3 M2EV@CaP高糖炎癥免疫調(diào)節(jié)與促成骨。a) 高糖下M2EV@CaP調(diào)控巨噬極化示意；b) 12 h炎癥基因（IL-6、CCL2、IL-1β）表達(dá)；c) 24 h M1蛋白Western與定量；d) NOS2/CD68免疫熒光及半定量；e) 成骨高糖炎癥下M2EV@CaP促BMSCs成骨示意；f) 7天成骨基因（BMP2、RUNX2、SP7）表達(dá)；g) 7天成骨蛋白Western與定量；h) 7 d ALP與14 d ARS染色及半定量

（4）M2EV@CaP通過(guò)Ca 2 +-Akt信號(hào)調(diào)節(jié)BMSC成骨分化

圖4a以流程圖形式概述研究策略：在HG+LPS模擬的糖尿病炎癥環(huán)境中，系統(tǒng)解析M2EV@CaP促進(jìn)BMSCs成骨的分子機(jī)制，為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和信號(hào)軸驗(yàn)證奠定框架。圖4b火山圖直觀呈現(xiàn)差異基因分布：與M2EV相比，M2EV@CaP組119個(gè)基因顯著上調(diào)（紅色）、119個(gè)基因下調(diào)（藍(lán)色），差異對(duì)稱且遠(yuǎn)離中線，提示CaP外殼顯著重塑轉(zhuǎn)錄譜。圖4c KEGG氣泡圖進(jìn)一步指出富集最顯著的前10條通路，其中PI3K/Akt、黏附、肌動(dòng)蛋白骨架及鈣信號(hào)氣泡直徑最大、顏色最深，表明其與成骨高度相關(guān)。圖4d共聚焦Fluo-4 AM顯示，M2EV@CaP組胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度較Control與M2EV提高約2倍，直觀證實(shí)游離Ca2?水平顯著升高；圖4e流式定量結(jié)果與共聚焦一致，平均熒光強(qiáng)度峰值右移，證明Ca2?負(fù)載具有群體一致性。圖4f免疫熒光中，Phalloidin標(biāo)記的F-肌動(dòng)蛋白（紅色）與ITGA5（綠色）在M2EV@CaP組絲束粗壯、共定位增多，加入BAPTA后熒光明顯減弱，表明Ca2?可調(diào)控骨架重塑與整合素表達(dá)；圖4h Western blot量化F/G-actin比值由0.45升至0.82，BAPTA回降至0.50，證實(shí)肌動(dòng)蛋白聚合依賴Ca2?。圖4i顯示p-Akt/Akt比值在M2EV@CaP組升高3.1倍，BAPTA預(yù)處理將其降至基線，明確Ca2?位于Akt上游；圖4j PI3K抑制劑LY294002實(shí)驗(yàn)表明，BMP2、OCN蛋白顯著下調(diào)，證明Akt活性是成骨蛋白表達(dá)的必要條件。圖4k qPCR同步顯示BMP2與RUNX2 mRNA在抑制條件下分別下降60%與55%，與蛋白水平一致，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄依賴關(guān)系；圖4l ALP染色可見(jiàn)M2EV@CaP組藍(lán)紫色最深，LY294002處理后染色明顯變淺，積分光密度下降50%，進(jìn)一步說(shuō)明PI3K/Akt軸介導(dǎo)早期成骨活性。綜上，圖4a–4l共同構(gòu)建“Ca2?-Akt-骨架重塑-成骨基因”完整證據(jù)鏈，闡明M2EV@CaP通過(guò)釋放鈣離子激活PI3K/Akt信號(hào)，從而增強(qiáng)BMSCs成骨分化的核心機(jī)制。

圖4 M2EV@CaP通過(guò)Ca 2 +-Akt信號(hào)調(diào)節(jié)BMSC成骨分化。a）M2EV@CaP促進(jìn)BMSC成骨分化的機(jī)制的示意圖；b）M2EV@CaP和M2 EV組之間差異表達(dá)基因的火山圖；c）KEGG富集分析，鑒定了M2EV@CaP和M2 EV組之間差異激活的前10個(gè)信號(hào)通路；d）不同處理3天后BMSC中Fluo-4 AM染色（綠色）的代表性熒光圖像和半定量分析；e）不同處理3天后BMSC中Fluo-4 AM熒光的代表性流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果和半定量分析；f）F-肌動(dòng)蛋白的代表性免疫熒光圖像（鬼筆環(huán)肽，綠色）和ITGA 5（紅色）。細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）染色；g）不同處理3天后BMSC中ITGA 5表達(dá)的Western印跡分析，以及用或不用M2EV@CaP和BAPTA-AM處理的BMSC中ITGA 5和RUNX 2的表達(dá)。h）通差異超離心進(jìn)行不同處理3天后，以及在用或不用M2EV@CaP和BAPTA-AM處理的BMSC中，肌動(dòng)蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析；i)不同處理3天后BMSC中p-Akt和總Akt表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡和半定量熱圖；j）用或不用M2EV@CaP和BAPTA-AM處理的BMSC中的成骨相關(guān)蛋白表達(dá)的Western印跡分析；k）成骨標(biāo)志物的相對(duì)mRNA表達(dá)水；l）用或不用M2EV@CaP和LY 294002處理的BMSC的代表性ALP染色圖像

（5）用于糖尿病大鼠顱骨缺損修復(fù)的M2EV@CaP/凝膠復(fù)合材料的工程設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)

圖5a通過(guò)流程圖展示了整體策略，其將M2EV@CaP均勻分散于GelMA溶液后，經(jīng)405 nm紫外光交聯(lián)，從而形成可注射且原位固化的復(fù)合水凝膠，并為后續(xù)局部遞送奠定技術(shù)路線。圖5b的SEM低倍圖像呈現(xiàn)貫通大孔結(jié)構(gòu)，孔徑約為100–200 μm，高倍視野可見(jiàn)礦化囊泡緊密貼附孔壁，由此直觀證實(shí)粒子成功載入且多孔微結(jié)構(gòu)保持完整。圖5c利用PKH26共聚焦三維重構(gòu)顯示，紅色熒光均勻布滿整個(gè)凝膠基質(zhì)，未見(jiàn)聚集或沉降，該結(jié)果說(shuō)明囊泡在三維網(wǎng)絡(luò)中穩(wěn)定分散，并可保障長(zhǎng)期均勻釋放。圖5d的元素分布圖表明，Ca信號(hào)僅出現(xiàn)在M2EV@CaP/gel組，與C、P重疊良好，EDS譜出現(xiàn)Ca-P特征峰，從而定量驗(yàn)證礦化殼完整保留。圖5e的壓縮力學(xué)測(cè)試顯示，三組應(yīng)力-應(yīng)變曲線幾乎重疊，Young’s模量約為8 kPa，表明粒子加入未削弱凝膠本體強(qiáng)度，可滿足缺損區(qū)早期機(jī)械需求。圖5f的流變結(jié)果表明，存儲(chǔ)模量G′全程高于損耗模量G?，且隨頻率平穩(wěn)上升，呈現(xiàn)典型彈性固體行為，為血管長(zhǎng)入和細(xì)胞駐留提供穩(wěn)定支架。圖5g通過(guò)時(shí)間軸展示，高糖高脂聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)糖尿病，血糖高于16.7 mmol·L?1后行雙側(cè)5 mm顱骨缺損，隨后原位注射材料，并在4周與8周取樣，由此形成完整療效評(píng)價(jià)周期。圖5h的micro-CT 3D重建可見(jiàn)，8周時(shí)M2EV@CaP/gel組缺損區(qū)幾乎閉合，骨橋連續(xù)，而對(duì)照組仍見(jiàn)明顯孔洞，直觀展示修復(fù)優(yōu)勢(shì)。圖5i提供的定量分析指出，BV/TV在4周達(dá)到37%，8周升至77%，顯著高于M2EV/gel的45%，且Tb.N與BMD同步提升，為療效提供統(tǒng)計(jì)學(xué)依據(jù)；同期組織學(xué)HE顯示新生骨板成熟，Masson膠原藍(lán)染致密排列，血管區(qū)豐富，證實(shí)基質(zhì)重塑與骨成熟度最優(yōu)。綜上，圖5a至圖5i形成從凝膠制備、力學(xué)性能到糖尿病缺損修復(fù)的完整證據(jù)鏈，表明M2EV@CaP/gel兼具緩釋、力學(xué)穩(wěn)定與免疫-成骨雙功能，顯著加速臨界骨缺損再生。

圖5 用于糖尿病大鼠顱骨缺損修復(fù)的M2EV@CaP/凝膠復(fù)合材料的工程設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)。a）通過(guò)UV交聯(lián)制備M2EV@CaP/凝膠的示意圖；b）凝膠、M2 EV/凝膠和M2EV@CaP/凝膠在不同放大倍數(shù)下的SEM圖；c）顯示PKH 26標(biāo)記的M2 EV和M2EV@CaP在水凝膠中的分布的3D共聚焦圖像。d）顯示C、Ca和P元素在M2 EV/凝膠和M2EV@CaP/凝膠中的分布的元素作圖，以及相應(yīng)的EDS光譜e）來(lái)自凝膠、M2 EV/凝膠和M2EV@CaP/凝膠的壓縮測(cè)試的代表性應(yīng)力-應(yīng)變曲線。f）流變學(xué)分析，顯示水凝膠在不同頻率下的儲(chǔ)能模量（G′）和損耗模量（G ′）；g）在糖尿病大鼠中建立顱骨骨缺損模型的實(shí)驗(yàn)程序的示意圖。h）在8周時(shí)基于骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV%）和骨小梁數(shù)目（Tb.N）的骨再生的定量分析；ii）代表性的顯微CT、HE和Masson三色染色圖像顯示了術(shù)后8周時(shí)各組（空白、凝膠、M2 EV/凝膠和M2EV@CaP/凝膠）中的骨再生代表性的顯微CT、HE和Masson三色染色圖

（6）M2巨噬細(xì)胞極化和成骨增強(qiáng)糖尿病性骨再生

圖6a 流式檢測(cè)顯示，術(shù)后10天各組CD86?CD11b? M1比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，20天M2EV@CaP/gel降至23.7%，顯著低于M2EV/gel的75.9%，表明其隨時(shí)間推移持續(xù)抑制促炎表型。圖6b與圖6d定量結(jié)果指出，4周RUNX2?與ALP?細(xì)胞在M2EV@CaP/gel組分別達(dá)到82%與57%，8周OCN?與BMP2?面積升至70%與60%，均顯著高于其余各組，體現(xiàn)成骨-礦化全程優(yōu)勢(shì)。圖6c與圖6d免疫熒光顯示，4周缺損內(nèi)p-Akt?CD90?細(xì)胞數(shù)在M2EV@CaP/gel為51，較M2EV/gel的30進(jìn)一步提升，表明Akt激活是體內(nèi)促成骨的關(guān)鍵機(jī)制。綜上，圖6a至圖6d共同構(gòu)建“M1→M2極化-Akt激活-成骨基因上調(diào)”完整證據(jù)鏈，闡明M2EV@CaP/gel通過(guò)免疫-成骨雙重調(diào)控顯著加速糖尿病骨缺損修復(fù)。

圖6 M2EV@CaP通過(guò)M2巨噬細(xì)胞極化和成骨增強(qiáng)糖尿病性骨再生。a) ）在植入后10和20天，對(duì)顱骨缺損區(qū)域中的CD 86 + CD 11b+細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量。；b）植入后4周時(shí)在顱骨缺損區(qū)域中RUNX 2（紅色）和ALP（綠色）以及在植入后8周后OCN（綠色）和BMP 2（紅色的表達(dá)免疫熒光染色圖像；c)植入后4周時(shí)在顱骨缺損區(qū)域中RUNX 2（紅色）和ALP（綠色）以及植入后8周OCN（綠色）和BMP 2（紅色）的表達(dá)免疫熒光染色圖像；d）免疫熒光結(jié)果的半定量分析