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針對上述問題，廣州醫(yī)科大學馮杜教授團隊提出“線粒體核樣自噬（nucleoid-phagy）”新機制：發(fā)現線粒體轉錄因子A（TFAM）可兼做自噬受體，通過其LIR2基序直接識別并綁定LC3，將泄漏到胞質的mtDNA精準投遞至自噬溶酶體降解，從而切斷cGAS-STING炎癥信號軸。該策略為細胞提供了“按需清除”游離mtDNA的主動防御，突破了傳統(tǒng)整體線粒體自噬無法精細處理單分子損傷的局限。該文章于2024年05月23日以《TFAM is an autophagy receptor that limits inflammation by binding to cytoplasmic mitochondrial DNA》為題發(fā)表于《Nature Cell Biology 》（DOI：10.1038/s41556-024-01419-6）。

（1）自噬參與細胞質暴露的mtDNA和TFAM的去除

應激狀態(tài)下，更多TFAM從TOM20標記的線粒體泄漏至細胞質（圖1a,b）；漸進式氧化應激會降低HeLa細胞和THP-1細胞中的TFAM與SQSTM1水平，同時升高LC3-II/LC3-I比率。溶酶體抑制劑Baf-A1而非蛋白酶體抑制劑MG-132，可在不影響轉錄的情況下恢復TFAM（圖1c,d）；自噬相關蛋白7（ATG7）基因敲除的HeLa細胞中，TFAM水平的下降被阻斷（圖1e,f），證實該過程依賴自噬。

通過NP-40僅通透質膜，可特異性檢測逃避線粒體自噬的泄漏類核，排除線粒體與細胞核DNA的干擾；該處理成功分離細胞質組分與致密細胞器組分，證實HeLa細胞（圖1g,h）和THP-1細胞中均存在TFAM向細胞質的釋放，且ATG7缺陷細胞中胞質TFAM積累增強（圖1i,j）。

共聚焦顯微鏡與PCR檢測顯示，應激狀態(tài)下線粒體DNA（mtDNA）顯著釋放到胞質，Baf-A1處理后釋放量進一步增加（圖1k,l）；氧化應激下，ATG7缺陷細胞的胞質mtDNA較對照細胞增多（圖1m-q），免疫金標記也證實這一結果（圖1r-t）。

圖1 自噬參與胞質暴露mtDNA和TFAM的清除（a）H₂O₂處理HeLa細胞線粒體外TFAM圖像；（b）對應百分比；（c、d）H₂O₂、MG-132和Baf-A1刺激HeLa細胞的SDS-PAGE結果及統(tǒng)計分析；（e、f）H₂O₂刺激的ATG7缺陷型和V2對照HeLa細胞的SDS-PAGE、免疫印跡結果及統(tǒng)計分析；（g、i）免疫印跡驗證；（h、j）對應統(tǒng)計分析；（k、l）ND1/ND4引物qPCR檢測胞質mtDNA；（m）H2O2刺激的ATG7缺陷型HeLa細胞線粒體外mtDNA代表性圖像；（n）對應百分比；（o）D-loop/ND2引物PCR檢測胞質mtDNA；（p、q）ND1/ND4引物qPCR檢測；（r、s）線粒體外mtDNA免疫電鏡圖像

（2）mtDNA-TFAM復合物與細胞質中的LC3B結合

應激條件下，HeLa和THP-1細胞中的mtDNA與TFAM仍保持結合狀態(tài)（圖2a–d）。亞細胞分離和細胞質DNA免疫沉淀實驗顯示，氧化應激會使細胞質中抗TFAM抗體上的mtDNA–TFAM復合物水平升高，且Baf-A1處理后該效應更顯著（圖2e–g）。通過抗LC3B抗體進行免疫共沉淀，結合RT-qPCR和PCR檢測相關mtDNA發(fā)現，氧化應激下與LC3B結合的mtDNA增多，Baf-A1抑制后該水平進一步上升（圖2h–j）。共聚焦顯微鏡觀察顯示，無應激時細胞質中GFP標記的LC3B（GFP-LC3B）斑點較少，經H2O2和Baf-A1處理后，GFP-LC3B水平升高且與泄漏的mtDNA共定位（圖2k,l）；ATP刺激的LPS預處理THP-1細胞中，LC3B同樣增多并與釋放的mtDNA共定位（圖2m,n）。此外，應激條件下HeLa和THP-1細胞中，LC3B與泄漏的TFAM也存在共定位（圖2o–r）。

圖2 mtDNA–TFAM復合物與細胞質中的LC3B結合。H₂O₂處理HeLa細胞中線粒體外mtDNA–TFAM復合物的代表性圖像（a）及共定位分析（b）；LPS+ATP處理THP-1細胞中線粒體外mtDNA–TFAM復合物的代表性圖像（c）及共定位分析（d）；（e）-（g）H₂O₂+Baf-A1刺激HeLa細胞胞質裂解物抗TFAM免疫沉淀，ND1（e）、ND4引物（f）qPCR及PCR（g）檢測沉淀mtDNA；同上處理HeLa細胞全細胞裂解物抗LC3B免疫沉淀，PCR（h）及ND1（i）、ND4引物（j）qPCR檢測沉淀mtDNA；（k）（l）（o）（p）H₂O₂+Baf-A1處理的GFP-LC3B穩(wěn)定轉染HeLa細胞中，胞質釋放mtDNA（k、l）或TFAM-FLAG（o、p）與GFP-LC3B共定位的圖像（k、o）及分析（l、p）；（m）（n）（q）（r）LPS+ATP+Baf-A1刺激THP-1細胞中，胞質釋放mtDNA（m、n）或TFAM（q、r）與LC3B共定位的圖像（m、q）及分析（n、r）

（3）TFAM與LC3B相互作用

氧化應激條件下，HeLa細胞胞質中TFAM-FLAG與GFP-LC3B發(fā)生共沉淀（圖3a,b）；炎癥和氧化應激條件下，THP-1細胞內源性LC3B與胞質TFAM共沉淀（圖3c）。HeLa細胞的半下拉實驗顯示，內源性和外源性TFAM均可被His-LC3B下拉（圖3d）。體外實驗中，大腸桿菌表達并純化的His-TFAM能下拉LC3家族的LC3A、LC3C、GABARAPL1和GABARAPL2，無法下拉GABARAP（圖3e）。

（4）TFAM通過自噬溶酶體途徑介導mtDNA的降解

通過 mRFP-eGFP-LC3B 區(qū)分自噬體與自溶酶體，應激條件下觀察到 LC3 與 TFAM、mtDNA 的共定位增加，部分 GFP 淬滅的紅色斑點提示其被遞送至高酸性自溶酶體（圖 4a–d）。穩(wěn)定轉染 GFP-LC3B 的 HeLa 細胞中，無刺激時 DsRed-TFAM 和 mtDNA 與 TOM20 標記的線粒體共定位，氧化應激后 GFP-LC3 與 TOM20- DsRed-TFAM、mtDNA 共定位增強。構建 TFAM-mRFP-eGFP 質粒后，正常條件下 TFAM-mRFP-eGFP 與 mtDNA、TOM20 標記的線粒體共定位（圖4e,f）；H₂O₂刺激后，TFAM/mtDNA 斑點失去線粒體共定位并呈現 GFP 淬滅的紅色熒光（圖 4e–h），證實其暴露于細胞質且被遞送至溶酶體。四色成像顯示，應激狀態(tài)下 DsRed-TFAM 與 GFP-LC3 及 LAMP1 標記的溶酶體共定位（圖 4i–l），提示大量 DsRed-TFAM 脫離線粒體，與 GFP-LC3 斑點和 LAMP1 標記的溶酶體共定位。

圖3 TFAM與LC3B的相互作用。（a）實驗策略示意圖；（b）H₂O₂和Baf-A1刺激的GFP-LC3B轉染且過表達TFAM-FLAG的HeLa細胞胞漿裂解液中，anti-FLAG免疫共沉淀驗證TFAM-FLAG與GFP-LC3B的相互作用；（c）LPS和ATP刺激的THP-1細胞胞漿裂解液中，anti-LC3B免疫共沉淀驗證TFAM與LC3B的相互作用；（d）重組His-LC3B下拉H₂O₂和Baf-A1處理的TFAM-FLAG過表達HeLa細胞全細胞裂解液中的TFAM及TFAM-FLAG；（e）重組His-TFAM下拉重組GST-LC3B

圖4 TFAM通過自噬溶酶體途徑介導mtDNA降解。（a）H₂O₂處理的HeLa細胞中mtDNA與GFP淬滅的RFP-LC3B共定位代表性圖像；（b）對應共定位分析；（c）H₂O₂處理的HeLa細胞中TFAM-FLAG與GFP淬滅的RFP-LC3B共定位代表性圖像；（d）對應共定位分析；（e）H₂O₂處理的HeLa細胞中TFAM與mtDNA共定位代表性圖像；（f）對應共定位分析；（g）（h）統(tǒng)計分析；（i）H₂O₂和Baf-A1刺激的GFP-LC3B穩(wěn)定轉染HeLa細胞中TFAM與自噬體、溶酶體共定位代表性圖像；（j）對應共定位分析；（k）（l）統(tǒng)計分析

（5）TFAM 敲低通過 cGAS–STING 通路加劇炎癥

線粒體應激增加會降低 TFAM 水平，同時激活 cGAS–STING 通路，使 HeLa 細胞和 THP-1 細胞中磷酸化干擾素調節(jié)因子 3（p-IRF3）與 IRF3 的比值升高。應激條件下，用 Baf-A1 抑制自噬會進一步增強 IRF3 磷酸化和 IFNβ 上調，無應激時也會輕微增強該信號。ATG7 缺陷 HeLa 細胞中，TFAM 水平保留較高，IRF3 激活（圖 5a、b）和 IFNβ 表達（圖 5c）均增加，證實 TFAM 介導的自噬降解減少會加劇該通路信號。ATG7 敲除細胞中 STING 水平升高（圖 5a）；STING 敲除 HeLa 細胞中，氧化應激無法降低 TFAM 或誘導對照組中出現的 IRF3 磷酸化（圖 5d–f），但胞質線粒體 DNA（mtDNA）釋放情況類似。應激條件下，TFAM 敲低激活的 STING 信號會進一步增強（圖 5g–j），而 STING 敲除細胞中，盡管仍保留胞質 mtDNA 應答，但 IRF3 激活被阻斷（圖 5k、l）。

圖5 TFAM敲低通過cGAS–STING通路加重炎癥。（a）ATG7缺陷和對照HeLa細胞的SDS-PAGE分析；（b）上述細胞p-IRF3/IRF3比值統(tǒng)計分析；（c）上述細胞IFNβ表達；（d）STING缺陷和對照HeLa細胞的SDS-PAGE分析；（e）上述細胞TFAM/β-tubulin比值統(tǒng)計分析；（f）上述細胞p-IRF3/IRF3比值統(tǒng)計分析；（g）TFAM敲低HeLa細胞的SDS-PAGE分析；（h）上述細胞p-IRF3/IRF3比值統(tǒng)計分析；（i）TFAM敲低THP-1細胞的SDS-PAGE分析；（j）上述細胞p-IRF3/IRF3比值統(tǒng)計分析；（k）H2O2處理下STING缺陷HeLa細胞的SDS-PAGE分析；（l）上述細胞p-IRF3/IRF3比值統(tǒng)計分析

（6）自噬受體可通過 LIR 基序與 LC3 相互作用

自噬受體可通過LIR基序與LC3相互作用，生物信息學分析預測缺失信號肽的成熟TFAM含LIR1和LIR2兩個LIR基序（Fig. 6a），相關變異體質粒的表達及線粒體定位已檢測。免疫共沉淀結果顯示，改變LIR2而非LIR1殘基會破壞與LC3B的相互作用，體外實驗也證實LIR2缺失的TFAM無法拉取LC3B（Fig. 6b-d），即TFAM的LIR2基序特異性介導其與LC3B的相互作用。在氧化應激（HeLa細胞中H₂O₂處理）或炎癥應激（THP-1細胞中LPS處理）下，與野生型TFAM相比，LIR2缺失的TFAM挽救的TFAM敲低細胞，其細胞質免疫沉淀復合物中檢測到更多mtDNA釋放（Fig. 6e-i），但LIR2改變不影響TFAM與mtDNA的相互作用；免疫熒光顯示氧化應激下LIR2缺失的TFAM過表達會導致更多TFAM和mtDNA釋放到細胞質（Fig. 6j-m），qPCR驗證H₂O₂處理后LIR2缺陷TFAM挽救的細胞中胞質mtDNA更多，且Δ4、Δ5、Δ6變異體無顯著差異，未受應激時LIR2缺陷單獨不觸發(fā)mtDNA釋放（Fig. 6n-q），表明LIR2缺陷的TFAM無法調控自噬介導的mtDNA降解，導致胞質mtDNA積累。氧化應激會誘導線粒體膜電位喪失和ROS生成增加，但野生型與LIR2缺失的TFAM過表達挽救組在 mitochondrial 表型（膜電位、ROS）及pH敏感mt-Keima探針檢測的線粒體自噬水平上均無明顯差異。人TFAM與秀麗隱桿線蟲HMG-5具有保守性，但HMG-5的LIR基序氨基酸序列不保守；免疫共沉淀顯示氧化應激下，HMG-5的LIR缺失（尤其是Δ3，91-94位氨基酸）會干擾其與LC3的相互作用，且與野生型HMG-5相比，H₂O₂處理后過表達HMG-5 Δ3的秀麗隱桿線蟲，其免疫反應（IRG-1表達）和抗氧化反應（CTL-1表達）均增強）。

圖6 TFAM的LIR基序對其與LC3B的相互作用及mtDNA降解的必要性。（a）典型LIR序列與TFAM的手動比對，及TFAM上LIR1或LIR2核心殘基突變或缺失相關的不同質粒示意圖；（b）H₂O₂和Baf-A1處理的HeLa細胞全細胞裂解液中，用抗FLAG共免疫沉淀驗證LC3B與不同TFAM-FLAG變體的相互作用（WB為蛋白質印跡）；（c）H₂O₂和Baf-A1處理的HeLa細胞全細胞裂解液中，用抗LC3B共免疫沉淀驗證LC3B與LIR1核心殘基缺失（Δ3）或LIR2核心殘基缺失（Δ6）的TFAM-FLAG的相互作用；（d）重組GST-TFAM Δ6無法拉取重組His-LC3B；（e–i）TFAM敲低的HeLa細胞經TFAM-FLAG WT或TFAM-FLAG Δ6挽救，H₂O₂刺激后用抗FLAG抗體免疫沉淀細胞質裂解物，通過qPCR檢測與細胞質TFAM-FLAG結合的mtDNA；（j–m）H₂O₂處理后，TFAM敲低并經TFAM-FLAG WT或TFAM-FLAG Δ6挽救的HeLa細胞中，線粒體外mtDNA或TFAM-FLAG的共聚焦圖像及百分比；（n–q）TFAM敲低的HeLa細胞經TFAM-FLAG WT或Δ6、Δ4、Δ5挽救，有無H₂O₂處理時通過qPCR（ND1、ND4引物）檢測細胞質mtDNA

（7）TFAM 介導的類核自噬可減弱 cGAS–STING 炎癥信號

TFAM 介導的類核自噬可減弱 cGAS–STING 炎癥信號。LIR2 缺失的 TFAM 在 TFAM 敲低的 THP-1 細胞（圖 7a–c）和 HeLa 細胞（圖 7f–h）中，應激后磷酸化 IRF3 和 STING 水平高于野生型 TFAM 拯救組，無應激時兩者表達水平相似（圖 7a,f），且這些細胞中 IFNβ 表達升高（圖 7d,e,i）。STING 敲除且 TFAM 敲低的 HeLa 細胞經野生型 TFAM、LIR2 缺失 TFAM、野生型 STING 或 LIR 基序改變的 STING 重構后，氧化應激下 LIR2 缺失 TFAM 與 STING LIR 變體的組合使自噬底物 SQSTM1 積累更多（圖 7j,k）。線粒體功能上，LIR2 缺失 TFAM 拯救的 TFAM 敲低細胞，其線粒體膜電位 ΔΨm 在應激前后與野生型 TFAM 表達細胞無差異，基礎狀態(tài)下 ROS 水平更高但過氧化物處理后無此差異（圖 7n,o）；兩組細胞耗氧率相當，但表達 LIR2 缺失 TFAM 的線粒體更易受氧化損傷（圖 7p）。TFAM 可通過結合 LC3 作為選擇性自噬受體，將線粒體釋放的 mtDNA 轉運至自噬溶酶體降解，此即類核自噬，該途徑能抵消 mtDNA 積累引發(fā)的炎癥（圖 7q）。