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針對(duì)上述問(wèn)題，武漢大學(xué)中南醫(yī)院李志強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)研究開(kāi)發(fā)了一種基于近紅外二區(qū)（NIR-II）有機(jī)分子MYM的光療平臺(tái)，將MYM封裝于293F細(xì)胞衍生的外泌體并用iRGD肽功能化形成MYM@iRGD-Exo。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)MYM@iRGD-Exo能有效穿透血腦屏障靶向GBM細(xì)胞，激光照射下可顯著抑制腫瘤發(fā)展，促進(jìn)T細(xì)胞浸潤(rùn)增強(qiáng)免疫反應(yīng)，RNA測(cè)序分析揭示了免疫反應(yīng)通路的激活，為GBM治療提供了一種整合精準(zhǔn)靶向遞送、多模態(tài)成像及協(xié)同治療效果的有效方法，有望克服現(xiàn)有治療局限并改善癌癥臨床結(jié)局。該文章于2025年6月20日以《NIR-II Engineered Exosome Nanotheranostic Probes for“Oriented Blasting”in Orthotopic Glioblastoma》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.5c01541）。

圖1.MYM@iRGD-Exo構(gòu)建的示意圖

（1）MYM@iRGD-Exo的表征

通過(guò)B3LYP/6–31G(d)基組進(jìn)行Gaussian DFT計(jì)算，確定了DT的HOMO和LUMO軌道表面（圖1 A）。1H NMR 和 13C NMR和MALDI-TOF-MS驗(yàn)證了所有中間體和MYM的結(jié)構(gòu)。MYM在約720 nm處有最大吸收（圖1 B），910 nm附近有最大發(fā)射波長(zhǎng)（圖1 C），808 nm激發(fā)下熒光發(fā)射光譜延伸至1100 nm。293F細(xì)胞分離的細(xì)胞外囊泡直徑約100 nm，呈碟狀，擠壓負(fù)載MYM后形態(tài)變化不顯著（圖1 D、圖1 E）。外泌體、MYM和MYM@iRGD-Exo的流體動(dòng)力學(xué)直徑分別為106.65±2.00 nm、1114.39±133.18 nm和116.85±7.88 nm（圖1 F），zeta電位值分別為–38.90±1.19 mV、4.70±0.25 mV和–26.77±3.60 mV（圖1 G）。MYM@iRGD-Exo紫外/可見(jiàn)吸收光譜在720 nm處顯示特征峰（圖1 H、圖1 I）。4°C PBS中儲(chǔ)存3天后，MYM@Exo和MYM@iRGD-Exo的尺寸和zeta電位無(wú)顯著變化（圖1 J、圖1 K）。熒光探針和電子自旋共振光譜法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MYM@iRGD-Exo在激光照射下主要產(chǎn)生?OH和O2?–，1O?產(chǎn)生量極少（圖1 L-1 N），DMPO和BMPO加合物產(chǎn)生強(qiáng)烈ESR信號(hào)（圖1 O）。MYM@iRGD-Exo在808 nm激光照射下有明顯溫度升高，且與材料濃度正相關(guān)（圖1 P、圖1 Q），光熱轉(zhuǎn)換效率達(dá)34.5%（圖1 R）。

圖2.MYM@iRGD-Exo的特性表征。（a）MYM的HOMO、LUMO和偶極矩計(jì)算結(jié)果（DFT B3LYP/6-31G(d)方法）；（b）MYM的吸收光譜；（c）MYM的熒光發(fā)射光譜；（d）囊泡的透射電鏡圖像；（e）MYM@iRGD-Exo的透射電鏡圖像；（f）囊泡和MYM@iRGD-Exo的流體動(dòng)力學(xué)直徑；（g）囊泡、MYM和MYM@iRGD-Exo的zeta電位測(cè)量；（h）MYM、囊泡和MYM@iRGD-Exo的紫外/可見(jiàn)光譜；（i）MYM（DMSO中）、囊泡（PBS中）和MYM@iRGD-Exo（PBS中）的顏色外觀；（j）MYM@iRGD-Exo在PBS中懸浮1、2、3天的zeta電位變化；（k）MYM@iRGD-Exo在PBS中懸浮1、2、3天的流體動(dòng)力學(xué)直徑變化；（l）MYM@iRGD-Exo在808 nm激光照射下產(chǎn)生的1O2；（m）MYM@iRGD-Exo在808 nm激光照射下產(chǎn)生的?OH；（n）MYM@iRGD-Exo在808 nm激光照射下產(chǎn)生的O2?–；（o）ESR光譜顯示MYM@iRGD-Exo產(chǎn)生的1O2、?OH和O2?–；（p）MYM@iRGD-Exo樣品（MYM，100μg/mL）在激光照射下的光熱加熱圖像；（q）不同濃度下MYM@iRGD-Exo在808 nm激光照射下的光熱加熱行為；（r）MYM@iRGD-Exo的光熱轉(zhuǎn)換效率

（2）體外PDT/PTT協(xié)同效應(yīng)和生物相容性

實(shí)驗(yàn)評(píng)估了MYM和MYM@iRGD-Exo的腫瘤治療診斷潛力。GBM U251細(xì)胞孵育2小時(shí)后呈現(xiàn)紅色熒光，與MitoTracker Green共染色顯示兩種化合物定位于線粒體（圖2A、2B）。CCK-8法顯示二者在暗光下無(wú)顯著毒性，激光照射下細(xì)胞活力下降，1000 nM時(shí)細(xì)胞死亡超90%（圖2C、2D）。DCFH-DA顯示僅MYM+L組和MYM@iRGD-Exo+L組產(chǎn)生顯著ROS（圖2E）。Calcein-AM/PI染色顯示此兩組幾乎全部細(xì)胞死亡，證實(shí)光療協(xié)同作用。JC-1染色顯示治療后線粒體膜電位降低。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示MYM+激光組癌細(xì)胞凋亡率50.41%、壞死率16.7%，MYM@iRGD-Exo+激光組凋亡率54.79%、壞死率17.3%，對(duì)照組極少凋亡或壞死（圖2F）。

圖3.MYM和MYM@iRGD-Exo在U251細(xì)胞中的特性。（a）MitoTracker Green（綠色）與MYM（紅色）在U251細(xì)胞中的共定位；（b）MitoTracker Green（綠色）與MYM@iRGD-Exo（紅色）在U251細(xì)胞中的共定位；（c）不同濃度的MYM對(duì)U251細(xì)胞相對(duì)活力的影響，包括暴露于808 nm激光照射（0.33 W/cm2）和不暴露的情況（n=3）；（d）不同濃度的MYM@iRGD-Exo對(duì)U251細(xì)胞相對(duì)活力的影響，包括暴露于808 nm激光照射（0.33 W/cm2）和不暴露的情況（n=3）；（e）不同處理后U251細(xì)胞內(nèi)的ROS生成、活/死細(xì)胞染色和JC-1染色；（f）通過(guò)FACS評(píng)估不同配方處理的U251細(xì)胞凋亡分析

（3）體外血腦屏障穿透與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤靶向

實(shí)驗(yàn)表明，iRGD肽因?qū)δ[瘤內(nèi)皮細(xì)胞上整合素的強(qiáng)親和力，可有效增強(qiáng)載體對(duì)腫瘤的穿透性。整合素（圖3B、3C）和NRP1/2在GBM組織中高表達(dá)，使iRGD對(duì)腫瘤部位的靶向性和可及性增強(qiáng)。體外BBB模型實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)電阻超250Ω時(shí)，BBB模型形成，共培養(yǎng)4小時(shí)后，MYM@iRGD-Exo的體外BBB穿透效率約25%，而單獨(dú)MYM或MYM@Exo無(wú)法穿過(guò)（圖3E）。將GL261細(xì)胞接種在BBB模型底部，共聚焦顯微鏡分析顯示GL261細(xì)胞中強(qiáng)烈紅色熒光，證實(shí)MYM@iRGD-Exo對(duì)GBM細(xì)胞靶向有效（圖3F、3G）。綜上，MYM@iRGD-Exo具備顯著的BBB穿透和GBM細(xì)胞靶向能力。

圖4.MYM@iRGD-Exo的BBB穿透效率和GBM靶向性。（a）通過(guò)HPEPDock軟件分析的iRGD與整合素的結(jié)合，展示了整合素αvβ3與iRGD復(fù)合物；（b）GBM組織中ITGAV的相對(duì)表達(dá)水平；（c）GBM組織中ITGB3的相對(duì)表達(dá)水平；（d）用于評(píng)估MYM@iRGD-Exo體外BBB穿透效率的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪疽鈭D；（e）MYM、MYM@Exo和MYM@iRGD-Exo的BBB穿透效率測(cè)量結(jié)果（n=3）；（f）共聚焦顯微鏡圖像顯示皿底部的GL261細(xì)胞，追蹤MYM細(xì)胞攝取的時(shí)間進(jìn)程（n=3）；（g）共聚焦顯微鏡圖像顯示皿底部的GL261細(xì)胞，追蹤MYM@iRGD-Exo細(xì)胞攝取的時(shí)間進(jìn)程（n=3）

（4）體內(nèi)熒光成像和光熱成像

研究顯示，MYM@iRGD-Exo在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤原位小鼠模型中具有良好的NIR-II成像和光熱成像效果。尾靜脈注射后，其信號(hào)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中6小時(shí)可檢測(cè)到，24小時(shí)達(dá)峰值后漸弱（圖4A）。離體腦組織熒光成像確認(rèn)了該結(jié)果（圖4B）。在主要器官組織的離體NIR-II熒光成像也進(jìn)行了觀察。注射后24小時(shí)，用808 nm激光照射腫瘤區(qū)5分鐘，溫度迅速升至近50°C，顯示了其有效的光熱效應(yīng)（圖4C、4D）。

圖5.MYM@iRGD-Exo的熒光成像和光熱成像。（a）GBM小鼠中MYM@Exo和MYM@iRGD-Exo的實(shí)時(shí)NIR-II成像；（b）小鼠腦組織的離體NIR-II熒光成像；（c）GBM小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的紅外熱成像；（d）激光照射5分鐘（808 nm，1.0 W/cm2）期間的溫度變化

（5）體內(nèi)光動(dòng)力治療與光熱治療協(xié)同療法

在C57BL/6J小鼠原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中驗(yàn)證了MYM@iRGD-Exo的抗癌活性（圖5A）。將帶瘤小鼠隨機(jī)分為PBS組、PBS+激光組、MYM@iRGD-Exo組、MYM@iRGD-Exo+激光組。注射后24小時(shí)，以1.0 W/cm2的功率用808 nm激光照射腦腫瘤5分鐘，每4天監(jiān)測(cè)一次腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)果顯示，MYM@iRGD-Exo+激光組的腫瘤抑制效果顯著（圖5B、5C），該組小鼠生存時(shí)間超過(guò)50天，而對(duì)照組約為35天（圖5D）。H&E染色顯示該組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)空泡化和核固縮現(xiàn)象（圖5E）。Ki67和TUNEL染色表明，經(jīng)808 nm激光照射的MYM@iRGD-Exo可使腫瘤細(xì)胞增殖減少、凋亡增加（圖5F）。

圖6 NIR-II圖像引導(dǎo)的MYM@iRGD-Exo光動(dòng)力治療/光熱治療。（A）治療MYM@iRGD-Exo實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖；（B，C）生物發(fā)光成像監(jiān)測(cè)GBM異種移植生長(zhǎng)（n=3）；（D）不同治療組GBM小鼠生存曲線（n=7）；（E）H&E染色證實(shí)腦切片中腫瘤存在；（F）Ki67和TUNEL染色評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡

（6）體內(nèi)激活抗腫瘤免疫

RNA測(cè)序表明，MYM@iRGD-Exo+L組與對(duì)照組相比有353個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中215個(gè)上調(diào)，138個(gè)下調(diào)（圖6A，S19）。KEGG通路富集分析顯示治療影響多個(gè)癌癥相關(guān)通路（圖6B）。GO分析顯示DEGs在多個(gè)生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能中顯著富集。GSEA顯示治療顯著激活細(xì)胞凋亡（圖6C），涉及線粒體蛋白復(fù)合物（圖6D），并富集免疫相關(guān)過(guò)程（圖6E）。mMCP-counter顯示治療組T細(xì)胞浸潤(rùn)增加（圖6F）。GSEA還表明TNF-α信號(hào)和IFN-γ反應(yīng)顯著激活（圖6G，6H）。蛋白 - 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)揭示了關(guān)鍵基因，治療組CD4+和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)顯著（圖6I）。這些結(jié)果表明治療后治療部位發(fā)生T細(xì)胞募集和激活。

圖7 MYM@iRGD-Exo激活抗腫瘤免疫。（A）顯示353個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）的火山圖，顯著上調(diào)基因紅色表示，下調(diào)基因藍(lán)色表示；（B）Circos圖可視化與DEGs相關(guān)的富集KEGG通路；（C）基因集富集分析（GSEA）顯示在MYM@iRGD-Exo處理的腫瘤組織中凋亡上調(diào)；（D）線粒體蛋白復(fù)合物下調(diào)；（E）山脈圖顯示GSEA識(shí)別的生物學(xué)過(guò)程；（F）比較對(duì)照組和治療組的浸潤(rùn)免疫細(xì)胞豐度；（G）GSEA表明在治療組中TNF-α信號(hào)通過(guò)NF - kB通路上調(diào)；（H）INF - γ反應(yīng)通路上調(diào)；（I）免疫熒光染色顯示CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在GBM腫瘤組織中的浸潤(rùn)

（7）體內(nèi)生物安全性

通過(guò)檢測(cè)血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、白蛋白（ALB）、血尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）和尿酸（UA）等生化指標(biāo)，評(píng)估了MYM@iRGD-Exo的生物安全性和生物相容性。結(jié)果表明，MYM@iRGD-Exo具有良好的生物安全性和生物相容性。