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針對上述問題，中科院動物所的顧奇團隊構建了一種可3D打印的物理-化學異質微凝膠-水凝膠雜化材料（GMMHM）。該材料兼具高力學強度（抗生理剪切力）和柔軟表面（促進內皮細胞黏附、血管新生），并具剪切稀化及自愈合特性，可同時用于嵌入式和擠出式生物打印。利用GMMHM，作者構建了含1億細胞/mL的厚血管化肝組織，內嵌可手術吻合的宏觀血管通道。將其植入85%肝切除的SD大鼠后，移植物在術中即可與宿主血管直接吻合，實現(xiàn)瞬時血流灌注并快速恢復肝功能，顯著延長動物存活時間，為急性肝衰竭等疾病的可移植治療提供了新的技術平臺。該文章于2025年4月4日以《A Microgel–Hydrogel Hybrid for Functional Compensation and Mechanical Stability in 3D Printed Cell-Dense Vascularized Liver Tissue》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202413940）。

圖1 3D生物打印微凝膠-水凝膠混合物用于可植入血管化肝組織的示意圖

（1）微凝膠-水凝膠雜化材料的設計

為了實現(xiàn)水凝膠封裝細胞的治療應用并促進其與宿主血管的直接吻合，開發(fā)了一種具有“雙重”軟硬特性的微凝膠-水凝膠混合物。GelMA微凝膠、HA-MA前體和Matrigel混合形成了GMMHM混合物，經過紫外線輻射和37°C培養(yǎng)，利用化學交聯(lián)和物理纏繞的協(xié)同作用（圖2A）。HA-MA大分子作為“繩索”交聯(lián)微凝膠以穩(wěn)定整體結構。GMMHM的微環(huán)境通過內部密集交聯(lián)和外部松散交聯(lián)增強了彈性特性，并支持細胞活動。GelMA具有熱敏性，微凝膠在37°C時會失去結構完整性。GMMHM水凝膠在紫外線輻射后形成，并在37°C下穩(wěn)定。通過不同的GMM替代度（45%、60%、75%）制備了三組微凝膠，且較低的替代度導致水凝膠結構的損壞。為增強共價交聯(lián)，將HA-MA前體添加至GMM中，75%替代度的GMM在37°C下穩(wěn)定。交聯(lián)后的GelMA微凝膠的彈性模量通過原子力顯微鏡測試，結果表明不同微凝膠內部和之間的空間異質性（圖S2B）。通過調節(jié)HA-MA濃度和GMM濃度，水凝膠的機械性能顯著變化，0.04% HA-MA與2.5% GMM組合可顯著增加有效楊氏模量（Eff.Y.mod）（圖2B，C）。進一步優(yōu)化通過加入Matrigel的GMMHM水凝膠，增強穩(wěn)定性和生物相容性，其機械性質類似于GMMHM（圖2F，G）。力學性能測試顯示GMMHM水凝膠的韌性和壓縮性優(yōu)于GMM（圖S2C，F(xiàn)）。水凝膠的微孔結構對機械性能和細胞生長至關重要，冷凍掃描電鏡（cryo-SEM）顯示GMMHM微結構具有顯著異質性，內部結構密集交聯(lián)，外部松散交聯(lián)（圖2H，I，J）。GMMHM的微孔結構顯著高于均勻水凝膠，支持了細胞附著和質量運輸（圖2K）。

圖2（A）通過改變UV與37 °C處理順序構建GMMHM與GMMHM?雜化水凝膠的示意圖；（B-H）依次為不同HA-MA、GMM、GelMA濃度及體系對比的彈性模量或儲能模量結果；（I-K）展示GMM、GMMH、GMMHM、GMMHM?及GMHM水凝膠的交聯(lián)結構示意圖、冷凍SEM圖像（黃色示微凝膠，標尺100 μm）及其孔面積占比與分布差異

（2）通過嵌入式打印制造具有大血管的直接血管吻合術

為實現(xiàn)營養(yǎng)物質傳遞和功能補償，工程化厚組織需要具有層次化大血管，能夠與宿主血管吻合，并能承受灌注帶來的機械剪切應力。GMMHM水凝膠混合物中的微凝膠為嵌入式3D打印提供足夠支持，作為模板形成所需的血管通道。通過平行板幾何和振蕩剪切流變學測試，評估了該混合物的流變特性（圖3A）。壓實后，混合物表現(xiàn)出強烈的剪切稀化行為（圖3B，C）。在5%和100%應變下，混合物展示了應變屈服和自愈合行為（圖3D）。當溫度低于32°C時，混合物在低頻下表現(xiàn)為固體反應（圖3E）。頻率增加至13 Hz時，混合物呈現(xiàn)賓漢流體行為，損失模量超過儲能模量（圖3F）。紫外線照射和37°C培養(yǎng)后，混合物交聯(lián)以保持結構完整性，墨水的儲能模量降至5 Pa，易于去除（圖3F）。因此，GMMHM混合物可作為支持水凝膠混合物，用于生物打印宏觀血管網絡并在交聯(lián)后穩(wěn)定通道（圖3G）。GMMHM能作為擠出矩陣進行生物打印。使用250 μm和400 μm噴嘴打印嵌入式3D螺旋通道，觀察到賓漢流體行為（圖3H–J）。噴嘴直徑直接影響墨水直徑，從而形成螺旋結構（圖3M）。不同打印速度影響通道直徑，例如，250 μm噴嘴可用于打印不同直徑的通道（253和750 μm）（圖3K,L）。為了制造層次化大血管，打印了1-2-4通道模型（圖3N,O）和雙螺旋通道模型（圖3P–R；）。去除墨水后，綠色染料溶液被灌注到打印的交聯(lián)混合物通道中。

圖3（A）嵌入式擠出打印構建GMMHM宏觀血管示意圖；（B）振蕩流變、黏度、時間-溫度掃描及UV/37 ℃處理后的儲能模量變化；（C）不同噴嘴直徑與打印速度對螺旋管腔直徑的影響；（D）一分二、四分叉及雙螺旋通道的光學圖像與示意圖；（E）GMMHM打印血管與宿主頸總動脈-頸靜脈直接吻合實現(xiàn)即時血流的示意圖及實拍

（3）3D生物打印結構中的初步血管生成和血管生成

為了模擬多尺度血管網絡，GMMHM水凝膠混合物中微凝膠提供支持，有助于內皮細胞自組裝和血管形成。通過封裝RFP-HUVECs和HFF聚集體于GMMH和GMMHM水凝膠中，研究了血管形態(tài)發(fā)生與血管生成。在GMMHM中，血管芽生長和分支較為明顯，GMMHM+加成長因子后，形成了更復雜的血管網絡（圖4B）。與此相比，GMMH水凝膠網絡較少，細胞聚集較多。使用MMP抑制劑GM6001處理后，GMMHM+中的血管生成顯著減少，表明血管生成依賴于水凝膠結構的降解（圖4D,E）。掃描電子顯微鏡（SEM）結果顯示，GMMHM+形成的毛細血管結構較長且較多（圖4C）。進一步評估GMMHM+的血管生成能力時，RFP-HUVECs在GMMHM+表面形成了致密單層，顯示出良好的細胞間互作（圖4F,H）。通過直接注射RFP-HUVECs，觀察到內皮細胞層在管腔表面形成，并通過微通道滲透FITC標記的葡聚糖，證明了內皮屏障功能。剪切應力作用下，血管芽從內腔擴展至GMMHM+水凝膠中，表現(xiàn)出較強的血管生成能力，遠超GMHM+水凝膠（圖4K）。血管生成后，綠色熒光微珠通過新形成的腔道進入水凝膠，證明了血管生成支持營養(yǎng)物質輸入（圖4L）。3D共聚焦顯微鏡圖像顯示，內皮細胞附著并向水凝膠擴展（圖4M）。以上結果表明，GMMHM+水凝膠通過微孔結構和異質剛度促進了血管網絡的形成，包括血管生成和血管生成過程（圖4I,J）。

圖4（A）GMMHM+水凝膠介導的血管新生、內皮化與出芽模式示意圖；（B-D）3 d共培養(yǎng)RFP-HUVEC/HFF在多種凝膠中的血管生成3D重構、SEM及管長/分支點定量；（E-G）HUVEC二維黏附、覆蓋率隨時間變化及CD31免疫染色；（H-K）微通道內HUVEC出芽、FITC微球示蹤灌注及5 d厚組織內3D血管網絡

（4）支持MSC和實質細胞活性

為了評估異質結構對細胞活力的影響，不同類型的細胞分別被包裹在GMMHM和GMMHM?水凝膠混合物中。HUVEC-HFF聚集體在GMMHM中的生物相容性顯著優(yōu)于GMM和GMMH（水凝膠），細胞在微凝膠表面展開展現(xiàn)了優(yōu)良的擴展性和分布（圖5B、E）。GFP-MSCs在微凝膠表面的共聚焦顯微鏡圖像顯示，MSC細胞展布廣泛，呈現(xiàn)典型的成纖維樣形態(tài)，且GMMHM的異質結構使細胞比在均勻結構的GMMHM?中分布更廣（圖5C、D、F）。這些結果表明，微凝膠的添加增強了細胞活性，可能與其較高的剛度和微孔結構有關（圖5A）。為了驗證GMMHM在支持原代肝細胞和ESC分化心肌細胞功能上的潛力，分別使用了原代人肝細胞（PHHs）和ESC分化心肌細胞作為模型。PHHs在GMMHM中培養(yǎng)后，維持了均一的活細胞群體（圖5G）。與GMMHM相比，PHHs在GMMHM中的代謝活性顯著提高，表現(xiàn)出更高的I期酶（CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4）表達，顯示了潛在的肝組織構建能力（圖5H）。此外，經過20天培養(yǎng)后，分化的心肌細胞在GMMHM中表現(xiàn)出明顯的自發(fā)收縮，表明GMMHM能有效支持不同組織模型的構建。這些結果表明，GMMHM水凝膠可以作為多種組織模型的支架。

圖5（A）GMMHM與GMMHM?內細胞活性示意圖；（B）HUVEC/HFF共培養(yǎng)24 h活/死染色；（C-D）GFP-MSC在兩種凝膠中第1、3、5天形態(tài)及分支面積定量；（E）GMM、GMMH、GMMHM中HUVEC/HFF 24 h存活率；（F-G）PHH活/死染色及CYP1A1、1A2、3A4代謝活性對比

（5）優(yōu)化三維空間構建組織模型的HCD方法

在模擬生理組織的水凝膠中，細胞密度是工程化組織成熟和功能的關鍵因素之一。3D生物打印的最大細胞密度為10M/mL，遠低于體內組織的細胞密度。以細胞聚集體為基礎的工程組織可能存在壞死區(qū)域，且更容易受到血管網絡密度的影響。通過平衡水凝膠混合物的剛度、組分比例與組織中的高細胞密度（HCD）可實現(xiàn)大血管網絡的構建（圖6A）。肝臟組織（圖6B）含有約100M/mL的肝細胞，具有密集的細胞微環(huán)境和血管（圖6C）。肝臟組織的彈性模量（Eff.Y.mod）分布呈現(xiàn)異質性（圖6J）。隨著細胞數(shù)量的增加，組織的體積明顯增加（圖6D）。HepG2和原代豬肝細胞（PPHs）的體積分別為350 μL和550 μL，約構成1億個細胞（圖S9C）。當細胞濃度為50M/mL時，GMMHM的Eff.Y.mod顯著下降，導致無法進行植入（圖6E）。為了優(yōu)化基質，1mL肝組織中的水凝膠體積設定為450 μL，以維持100M/mL的細胞密度（圖6F）。SEM圖像顯示細胞被水凝膠混合物包裹，呈蜂窩狀結構（圖6G-I）。含有0.6% GMM和0.56% HA–MA的水凝膠混合物的Eff.Y.mod與肝臟表面相當（圖6K）。該水凝膠具有優(yōu)異的生物相容性（圖6L），適用于后續(xù)構建具有HCD的植入肝臟組織。HepG2細胞的HCD增加了混合物的剪切模量，而未影響其壓縮模量（圖6M,N），增強了混合物的穩(wěn)定性，以承受血流。所有結果表明，新設計的GMMHM混合物（nGMMHM）適合用于構建具有高細胞密度的組織。

圖6（A）高細胞密度肝組織構建示意圖；（B）小鼠肝組織光學圖及內部SEM（50 μm）；（C）100 M HepG2/PPH分布量化；（D）含/不含100 M PPH的GMMHM彈性模量對比；（E）不同GMM/HA-MA配比及含/不含HepG2的冷凍-SEM（黃：微凝膠，粉：細胞，100/20 μm）與SEM（10 μm）；（F）肝組織不同區(qū)域與GMMHM配比的彈性模量、剪切模量、壓縮模量及HepG2存活率比較

（6）細胞-高密度水凝膠雜化物促進肝臟功能的研究

研究表明，高細胞密度（HCD）在保證細胞間相互作用和促進組織形成方面起著關鍵作用。除了評估細胞存活率外，還對HepG2和PPHs在混合培養(yǎng)中7天后的肝功能進行了評估。免疫染色和qPCR結果表明，HepG2基質中人類白蛋白（hAlb）和α1-抗胰蛋白酶（AAT）表達水平較高。此外，肝臟特異性基因（如肝細胞核因子4α（HNF4α）和非半乳糖蛋白受體1（ASGPR1））的表達也有所上升，表明肝細胞功能的成熟（圖7A，B）。ALB和CK18的表達與細胞密度顯著相關，進一步驗證了HCD的重要性（圖7C，D）。HNF4α的高表達表明肝細胞在混合物中的成熟（圖7E）。這些結果表明，組織中PPH細胞的密度越高，肝功能越強，表明HCD對于人工肝組織的構建至關重要。此外，評估了通過嵌入式生物打印在nGMMHM中構建大血管的性能。添加黃原膠（XG）后，GMMH中的3D“+”通道結構和2D“一對二”通道的保真度有所提高（圖S10C，D）。XG濃度增加導致混合物的粘度增大。添加了0.5 wt% XG的GMMH混合物與1.2 wt% XG的混合物粘度相當（圖S10F）。交聯(lián)后的儲能模量未受XG或Matrigel影響。然而，含HepG2和HCD的混合物儲能模量從500 Pa增加到820 Pa。因此，選擇含0.5% XG的nGMMHM配方用于后續(xù)實驗。

圖7（A、B）體外培養(yǎng)7天的不同細胞密度的PPH肝組織的免疫染色共聚焦熒光圖像（比例尺：50 μm）。（C-E）不同細胞密度的PPH雜交體中AL B、CK 18和HNF 4β表達水平的比較

（7）SD大鼠工程化血管化肝的快速功能支持

3D生物打印的器官在體外構建為解決器官捐獻不足提供了潛力。為在急性肝衰竭的SD大鼠中提供肝臟功能支持，將生物打印的具有高細胞密度（HCD）的血管化組織直接與宿主血管進行外科吻合（圖8A）。這證明了在體內肝功能的補償作用。通過85%的肝切除術建立急性肝衰竭模型（圖8A，B），結果顯示，移植含有PPHs的工程肝組織可延長生存時間，從2.5小時增加到12小時，表明移植的肝組織對損傷的肝臟提供了功能補償。與HepG2組相比，PPHs組表現(xiàn)出更好的補償效果（圖8E）。血液生化分析顯示，經過PPHs治療3小時后，血清氨水平顯著降低，表明PPHs組對解毒有直接或間接支持作用（圖8G）。此外，AST、GLB和ALT水平降低，進一步證明肝損傷得到改善。工程肝臟在移植后3小時和10小時被取出分析（圖8I）。組織中的通道內含有紅血球，表面平滑無纖維蛋白沉積，表明通道通暢。與遠離通道的細胞相比，細胞形態(tài)變化不明顯，且ALB的表達在10小時時顯著高于3小時樣本。此外，移植5天后的100 M/mL HepG2組織也顯示ALB表達增加，表明工程肝組織具有一定功能。這些結果表明，工程肝組織有效支持肝臟功能并減輕PH引起的高氨血癥。

圖8（A）血管化肝組織經頸總動脈-頸靜脈直接吻合植入85%肝切除衰竭大鼠示意圖；（B）手術造模及切除肝臟照片；（C）六角棱柱移植物內紅色通道與綠色熒光微粒示蹤（標尺1 mm）；（D）吻合后移植物血流灌注及植入體實物圖；（E）移植組與對照組生存曲線、血紅蛋白及血氨、AST、ALT、GLB、A/G、ALB生化指標；（F）移植3 h與10 h肝組織HE與ALB染色（標尺20×50 μm、63×20 μm）