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針對上述問題，溫州醫(yī)科大學張洪波、復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院周世崇/常才團隊制備了一種共載青蒿琥酯（ARS）和吲哚青綠（ICG）的仿生低密度脂蛋白（LDL），并將其與氨基乙基茴香酰胺（AEAA）偶聯(lián)，以特異性抑制TNBC中的ECM CAFs和癌細胞。通過空間轉錄組測序和空間代謝組測序，評估了ECM CAFs在TNBC光熱治療耐受性中的作用，并進一步研究了ARS如何調(diào)節(jié)CAFs細胞中的絲氨酸穩(wěn)態(tài)和MAPK通路中GTP酶的活性。本研究揭示了限制ICG介導光熱治療在臨床試驗中療效的關鍵原因，為有效治療TNBC并推動光熱治療的臨床轉化提供了新的思路。該文章于2025年6月17日以《Artesunate Nanoplatform Targets the Serine–MAPK Axis in Cancer-Associated Fibroblasts to Reverse Photothermal Resistance in Triple-Negative Breast Cancer》為題發(fā)表于《Advanced Materials》上（DOI:10.1002/adma.202502617）。

研究示意圖

（1）CAF參與腫瘤對PTT的耐藥性

為探究不同細胞群HSP表達情況，對公開的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)進行了再分析，結果顯示CAFs的HSP mRNA水平高于其他細胞群，提示其具有更強的耐熱性（圖1A）。在Balb/c裸鼠模型中，評估了游離ICG介導的PTT效果：共植入CAFs和MDA-MB-231細胞的小鼠對治療反應較弱（圖1B）。此外，Eo771腫瘤模型中，游離ICG介導的PTT后ECM CAFs標志物表達顯著升高（圖1C）。綜上，CAFs，尤其是ECM CAFs，在TNBC對PTT的耐受性中具有關鍵作用。結果顯示，PLGA負載ARS可下調(diào)兩種CAF亞型中Atf4的表達（圖1D）。為進一步增強PTT敏感性，構建了以低密度脂蛋白（LDL）為載體的ARS遞送系統(tǒng)（aLDL@A），并通過茴香酰胺（A-aLDL@A）及吲哚青綠（ICG）（AI-aLDL@A）進行表面修飾（圖1E）。該系統(tǒng)利用PEG2000連接劑，其一端與DSPE結合嵌入載體內(nèi)，另一端的AEAA暴露在外，實現(xiàn)對高表達sigma-1受體的CAFs的靶向，同時ICG分子也位于納米顆粒表面，有助于激光誘導的光熱治療。由于apoB-100骨架的存在，aLDL還具有對TNBC細胞的親和力，因此該平臺可雙重靶向CAFs與TNBC細胞。所得納米平臺為球形，粒徑約60 nm（圖1F），LDL修飾后無顯著尺寸變化，具良好水溶性和24小時內(nèi)穩(wěn)定性（圖1G）。UV光譜驗證了ICG與ARS納米平臺的成功偶聯(lián)（圖1H）。體外靶向實驗表明，AI-aLDL對人CAFs、人乳腺癌細胞、小鼠成纖維細胞及TNBC細胞均具有良好的親和力（圖1I）。體內(nèi)研究進一步證實，AI-aLDL在人CAF和MDA-MB-231細胞共植入模型中積累更多（圖1J），顯示出良好的CAF靶向能力。綜上，該ARS納米平臺具備優(yōu)異的CAF與TNBC雙靶向性能，可介導PTT誘導的細胞殺傷，并抑制IL-6分泌。

圖1 光熱治療耐藥性研究及青蒿琥酯納米平臺的表征。（A） 不同細胞群中熱休克蛋白mRNA表達水平的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)；（B） PTT治療后第6天對照組和纖維化組腫瘤重量的比較；（C） 免疫印跡法評估對照組和ICG介導PTT處理組織中ECM CAF標志物表達水平；（D） 對照組、PD-1單抗組和聯(lián)合治療組中ECM CAFs和傷口愈合CAFs的ATF4表達；（E） 雙靶向青蒿琥酯納米平臺結構示意圖；（F） LDL@A和AI-aLDL@A的FESEM圖像；（G） 不同時間點LDL@A和AI-aLDL@A的水合尺寸；（H） AI-aLDL@A、A-aLDL@A和游離ICG的紫外吸光度光譜；（I） 通過激光共聚焦顯微鏡評估AI-aLDL對CAFs和TNBC細胞的靶向性；（J） 靜脈注射48小時內(nèi)小鼠的代表性熒光圖像及兩側腫瘤熒光強度的定量分析

（2）ARS 納米平臺可使 TNBC 細胞對 ICG 介導的 PTT敏感性

在多種三陰性乳腺癌（TNBC）小鼠模型中驗證了ARS納米平臺的治療效果（圖2A）。在人源TNBC異種移植瘤模型中，該平臺顯著抑制腫瘤生長（圖2B, C），證實其通過特異性抑制ECM型癌相關成纖維細胞（CAFs）可增強光熱治療（PTT）療效。與單獨PTT組（I-LDL+L）相比，聯(lián)合治療組腫瘤組織中應激相關蛋白（HSP70、Ras、JNK和RhoA）表達水平降低（圖2D），JNK表達亦明顯下降（圖2E），提示ARS可緩解PTT誘導的腫瘤應激。在Eo771 TNBC模型中，ARS平臺再次顯示出良好的治療效果，并顯著抑制JNK表達（圖2F, G）。免疫熒光結果顯示，PTT可引發(fā)ECM CAFs增加及ATF4上調(diào)，而ARS干預有效緩解這一現(xiàn)象（圖2H, I）。此外，血清炎癥因子檢測表明，ARS可減輕PTT引發(fā)的炎癥風暴和相關纖維化（圖2J）。聯(lián)合治療還顯著下調(diào)TNC與MYLK的表達（圖2K），進一步證實ARS通過緩解CAF應激狀態(tài)提升PTT敏感性，其設計策略具有顯著優(yōu)勢。

圖2 青蒿琥酯納米平臺在多種TNBC模型中緩解PTT后應激反應的表征。（A）體內(nèi)實驗示意圖；（B）MDA-MB-231模型中納米藥物處理后的腫瘤反應曲線；（C）MDA-MB-468模型中納米藥物處理后的腫瘤反應曲線；（D）I-LDL+L和I-LDL@A+L組小鼠腫瘤組織中HSP70、JNK、RhoA和Ras的表達；（E）小鼠腫瘤組織中JNK表達的免疫組化圖像；（F）Eo771小鼠腫瘤模型中納米藥物處理后的腫瘤反應曲線；（G）不同組小鼠腫瘤組織中應激相關蛋白的表達；（H）腫瘤組織中TNC和MYLK表達分布的代表性免疫熒光圖像；（I）控制組和I-LDL+L組小鼠組織中ATF4表達的免疫印跡；（J）不同組小鼠治療后血清中炎癥因子的濃度；（K）不同組Eo771腫瘤中TNC的免疫熒光強度定量結果

（3）基于空間轉錄組分析ECM CAFs形成的組織抗性屏障與PTT抗性關系

在I-LDL+L組中，腫瘤邊緣CAFs與巨噬細胞標志物高表達且共定位，提示由ECM CAFs與漿液樣巨噬細胞形成了類似免疫屏障的組織阻力結構，而聯(lián)合治療（I-LDL@A+L）顯著削弱了該屏障（圖3A）。通過分析SPP1通路發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細胞與ECM CAFs及傷口愈合CAFs存在強相互作用，尤以ECM CAFs為主（圖3B）。單細胞RNA測序和空間轉錄組進一步證實ECM CAFs與漿液樣巨噬細胞間存在緊密互作及空間共定位（圖3C, D），多重免疫熒光的共表達結果也進一步驗證了這一發(fā)現(xiàn)（圖3E, F）。此外，聯(lián)合治療可下調(diào)血管附近區(qū)域（0–40 μm）ATF4表達（圖3G），表明ARS可緩解腫瘤應激，減輕纖維化。IL-6/STAT3信號通路分析也顯示ECM CAFs與漿液樣巨噬細胞在該通路中相互作用（圖3H），提示ARS通過干預該通路削弱二者聯(lián)動，進而減少組織阻力屏障形成。MDA-MB-231模型中TNC和MYLK水平的降低進一步驗證了ARS對ECM CAFs的抑制作用（圖3I）。綜上，ARS納米平臺通過干預ECM CAFs與漿液樣巨噬細胞的相互作用，有效削弱了腫瘤組織中的物理與免疫屏障。

圖3 ECM CAFs在PTT耐藥作用。（A）不同細胞類型的空間分布預測及空間映射；（B）SPP1信號通路中不同CAF亞型與巨噬細胞的相互作用強度；（C）ECM CAFs和傷口愈合CAFs與各種TAM亞型的相互作用強度；（D）不同組腫瘤組織的H&E染色圖像及ECM CAFs和漿細胞樣巨噬細胞的空間分布預測；（E）I-LDL+Laser組腫瘤組織中SPP1和TNC分布的多重免疫熒光評估；（F） 不同巨噬細胞亞型和CAF亞型中TNC和SPP1表達的點圖；（G）ATF4基因表達水平與選定腫瘤血管區(qū)域距離的關系；（H）IL-6信號通路中ECM CAFs、傷口愈合CAFs與各種TAM亞型的相互作用強度；（I）不同組MDA-MB-231腫瘤中TNC的免疫熒光強度定量結果

（4）絲氨酸代謝在ECM CAFs中更活躍

ATF4是CAFs應激的重要標志物，也參與調(diào)控絲氨酸合成關鍵酶的表達?；贑AF亞型的轉錄特征分析發(fā)現(xiàn)，ECM CAFs在氨基糖、核糖核苷酸代謝、TCA循環(huán)和磷酸戊糖途徑中顯著富集（圖4A）?？臻g代謝組分析顯示，與對照相比，A-aLDL@A組腫瘤組織中尿苷5'-單磷酸、鳥苷單磷酸和尿嘧啶含量下降（圖4B），而這些代謝物在ECM CAFs中表達水平高于其他區(qū)域，提示其代謝活性強（圖4C）。此外，ECM CAFs在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路中高度活躍（圖4D），提示絲氨酸代謝是其潛在靶點。盡管ECM CAFs與漿液樣巨噬細胞的代謝偽時間軌跡相似（圖4E），但在膽堿、胸腺嘧啶等代謝物含量上，ECM CAFs明顯更高（圖4F），進一步支持其代謝特異性。代謝通路富集分析亦顯示，A-aLDL@A處理后，腫瘤組織中絲氨酸和膽堿通路受到顯著調(diào)控（圖4G）。綜上，ARS納米平臺通過干預絲氨酸代謝，有效抑制ECM CAFs的代謝活性，為其靶向治療提供新策略。

圖4 ECM CAFs與絲氨酸代謝高度相關。（A）基于單細胞RNA測序的基因表達預測不同CAF亞型在各種代謝途徑中的表達水平；（B）對照組和A-aLDL@A組腫瘤組織中代表性代謝物（核苷酸）的空間映射；（C）ECM CAF區(qū)域與其他區(qū)域中尿苷5'-單磷酸（嘧啶核苷酸）和膽堿（一碳單位）表達水平的比較；（D）基于ECM CAF區(qū)域與其他區(qū)域代謝物表達的代謝途徑富集分析；（E）ECM CAFs和漿細胞樣巨噬細胞中代謝物強度分布的偽時間分析；（F）ECM CAFs和漿細胞樣巨噬細胞中膽堿、胸腺嘧啶及代謝物表達水平的比較；（G）基于對照組和A-aLDL@A組所有代謝物表達的前10個富集代謝途徑

（5）ARS納米平臺抑制CAFs中的MAPK級聯(lián)反應和絲氨酸穩(wěn)態(tài)

為闡明ARS納米平臺逆轉光熱治療（PTT）抗性的機制（圖5A），對對照組與A-aLDL@A治療組腫瘤組織進行轉錄組、蛋白質組及代謝組聯(lián)合分析。結果顯示，ECM CAFs中MAPK通路活性顯著高于其他亞型（圖5B），而ARS處理后MAPK通路相關基因和蛋白表達明顯下調(diào)（圖S14A，支持信息；圖5C）。同時，ARS還顯著抑制一碳代謝通路，提示其可聯(lián)合干預ECM CAFs中的MAPK級聯(lián)與絲氨酸代謝。進一步研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸耗竭可導致MAPK通路相關基因在蛋白水平下降、轉錄水平補償性升高（圖5D, E），可能與翻譯后修飾障礙有關。此外，絲氨酸耗竭顯著影響線粒體功能，導致其內(nèi)絲氨酸積累（圖5F）。利用^13C標記示蹤，發(fā)現(xiàn)絲氨酸耗竭后，^13C標記蛋白主要富集于核苷酸代謝、CoA活性與GTP酶相關路徑（圖5G），提示其通過干擾能量代謝和GTP酶活性，進而抑制CAFs中MAPK信號傳導。綜上，ARS納米平臺通過靶向絲氨酸代謝干擾MAPK通路，有效逆轉CAFs介導的PTT耐受。

圖5 CAFs中絲氨酸調(diào)控MAPK通路的機制。（A）青蒿琥酯納米平臺在CAFs中的調(diào)控機制示意圖；（B）不同CAF亞型中MAPK通路的基因表達特征評分分析；（C）基于差異蛋白的通路富集分析（A-aLDL@A與對照組比較，下調(diào)蛋白前100名），重點通路用紅色標出；（D）絲氨酸剝奪不同時間后CAFs中MAPK通路相關蛋白的表達；（E）絲氨酸剝奪不同時間后CAFs中MAPK通路相關基因的轉錄表達；（F）絲氨酸剝奪48小時后CAFs中線粒體形態(tài)變化的超高分辨率激光共聚焦顯微鏡評估及定量分析；（G）13C標記絲氨酸處理12至48小時后CAFs中差異蛋白的GO通路富集分析

（6）絲氨酸耗竭影響CAF中的GTP酶活性

在熱應激與蛋白質折疊過程中，差異表達蛋白主要關聯(lián)于HSP70，其穩(wěn)定性依賴DNAJ家族蛋白調(diào)節(jié)ATP酶與GTP酶活性，同時HSP70也是GTP在細胞內(nèi)運輸?shù)年P鍵載體（圖6A）。研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸耗竭可導致HSP70從細胞膜轉移至細胞核周圍（圖6B），進而影響其向MAPK通路中GTP酶如Ras與RhoA的GTP供應（圖6C）。排除PHGDH抑制劑NCT-503對MAPK通路的直接作用后（圖6D），進一步證實絲氨酸耗竭通過干擾核苷酸代謝與GTP穩(wěn)態(tài)，引發(fā)內(nèi)質網(wǎng)應激并改變HSP70定位。這一現(xiàn)象在L929成纖維細胞中同樣觀察到（圖6E, F）。同位素標記蛋白分析顯示，MAP2K7不僅參與MAPK信號轉導，還在熱應激響應中發(fā)揮關鍵作用（圖6A, G），其在ICG介導的PTT治療后于Eo771腫瘤組織中顯著上調(diào)（圖6H）。綜上，絲氨酸耗竭通過影響HSP70功能與MAPK通路活性增強PTT效果，并揭示MAP2K7為潛在增敏靶點。

圖6 HSP70在絲氨酸調(diào)控MAPK通路中的作用。（A）13C標記絲氨酸處理48小時與12小時差異蛋白中具有蛋白質折疊和熱反應功能的蛋白，HSP70相關蛋白用紅框標出；（B）超高分辨率共聚焦顯微鏡評估絲氨酸剝奪對CAFs中HSP70（紅色）、TOM20（藍色）和ATP5a1（綠色）分布的影響；（C）免疫沉淀后質譜分析評估CAFs中與HSP70相互作用蛋白在對照組和絲氨酸剝奪組48小時后的表達變化，顯著變化蛋白和與能量代謝最相關蛋白用紅色標出；（D）不同絲氨酸來源對CAFs中MAPK通路相關蛋白的抑制作用的免疫印跡分析；（E）L929成纖維細胞系絲氨酸剝奪48小時對MAPK相關基因影響的免疫印跡和qPCR驗證結果；（F）L929成纖維細胞系絲氨酸剝奪48小時對HSP70分布影響的激光共聚焦顯微鏡驗證結果；（G）所有標記有13C絲氨酸位點的鑒定肽段中蛋白的GO通路富集分析，感興趣通路用紅框標出；（H） PTT組和對照組Eo771腫瘤中MAP2K7的表達（n = 4獨立樣本）

（7）MAP2K7可用作PTT致敏的新靶點

為驗證MAP2K7在光熱治療（PTT）中的作用，使用MKK7抑制劑DTP3進行干預，結果顯示DTP3可顯著增強PTT的抗腫瘤效果（圖7A, B）。進一步構建體外耐熱CAFs模型（CAFs ^HR）（圖7C, D），發(fā)現(xiàn)其在無ARS納米平臺的PTT下表現(xiàn)出更強的熱耐受性（圖7E），同時具備更強的損傷修復能力、增殖能力及炎癥因子分泌水平（圖7F, G）。CAFs ^HR中TNC和MYLK表達上調(diào)（圖7H），提示PTT可誘導CAFs向ECM CAFs表型轉化。蛋白組學分析進一步確認，MAP2K7在CAFs ^HR中高表達（圖7I），并參與富含膠原的細胞外基質和整合素通路調(diào)控?；蚣患治觯℅SEA）結果表明，CAFs ^HR中MAPK通路、ERK1/2級聯(lián)及MAP激酶活性顯著增強（圖7J），ATF4與絲氨酸代謝相關信號亦同步上調(diào)（圖7K）。綜上，MAP2K7在促進CAFs耐熱性、增強MAPK級聯(lián)和絲氨酸代謝中發(fā)揮關鍵作用，是誘導PTT耐受的潛在調(diào)控因子。

圖7 耐熱CAFs的驗證。（A） 結晶紫染色評估PTT單獨及聯(lián)合MKK7抑制劑(DTP3)對CAFs的殺傷效果；（B）CCK-8法評估PTT單獨及聯(lián)合MKK7抑制劑(DTP3)對CAFs的殺傷效果；（C）體外誘導CAFs ^HR示意圖；（D）CAFs和CAFs ^HR的光學顯微鏡圖；（E）PTT后96小時CAFs的結晶紫染色，激光照射區(qū)域用紅色虛線標出；（F）比較 CAFs和CAFs^HR在96小時內(nèi)的遷移能力；（G）CAFs和CAFs^HR在6天內(nèi)的生長曲線；（H）CAFs和CAFs ^HR中TNC和MYLK表達的熱圖；（I）CAFs和CAFs^HR之間差異蛋白表達的火山圖；（J）基于CAFs和CAFs^HR蛋白譜的GSEA分析；（K）免疫印跡法評估CAFs和CAFs ^HR中ATF4的表達