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針對上述問題，重慶醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院宋錦璘、胡赟團隊開發(fā)一種基于微針（microneedles, MNs）的藥物遞送平臺（MSN-LA@MNs），搭載一氧化氮（NO）驅動的納米馬達，用于L-精氨酸的精準靶向遞送。該系統(tǒng)巧妙地利用了機械力作用下的巨噬細胞和組織中iNOS表達上調這一天然優(yōu)勢，通過 iNOS 催化L-精氨酸生成 NO，為納米顆粒提供自主推進力。此外，微針的透皮給藥技術還具有操作簡便、無痛、微創(chuàng)等優(yōu)勢。在力誘導的大鼠OTM模型中，證實MSN-LA@MNs能增強巨噬細胞胞葬作用，并在iNOS的引導下動態(tài)調節(jié)無菌性炎癥水平，從而促進OTM進程，為調控OTM等力學生物學過程提供了納米馬達介導的代謝靶向策略。該文章于2025年3月3日以《Microneedles Loaded with Nitric-Oxide Driven Nanomotors Improve Force-Induced Efferocytosis Impairment and Sterile Inflammation by Revitalizing Macrophage Energy Metabolism》為題發(fā)表于《ACS NANO》（DOI：10.1021/acsnano.5c01877。

研究示意圖.（a）加載有一氧化氮驅動的納米馬達的微針的基本設計的示意圖。（b）機械力通過精氨酸代謝、TCA循環(huán)和線粒體功能的代謝級聯(lián)損傷破壞巨噬細胞胞吐作用并引發(fā)無菌炎癥的機制。（c）MSN-LA@ MN在OTM中的應用和藥物遞送機制。（d）MSN-LA@MNs如何通過恢復巨噬細胞能量代謝從而促進OTM來改善力誘導的胞吐功能受損和無菌性炎癥

（1）機械力損害巨噬細胞胞葬作用并激活無菌性炎癥

研究人員對RNA-seq數據集GSE210827進行分析，發(fā)現加載組有265個基因下調、374個上調（圖1b），且凋亡和炎癥免疫通路顯著激活（圖1c）。大鼠OTM模型中，機械力加載的牙周組織TUNEL陽性細胞增多，與CD68陽性細胞共定位減少（圖1e），且IL-1β陽性表達升高（圖1f）。體外細胞壓縮力加載模型顯示，機械力抑制巨噬細胞胞葬作用（圖1h,i），且促炎細胞因子顯著上調，胞葬作用增強劑可逆轉這一現象（圖1j,k）。這些結果表明，機械力可能通過破壞巨噬細胞胞葬作用增強炎癥反應。

圖1 機械力損傷巨噬細胞胞葬作用并激活無菌性炎癥。（a）小鼠脛骨施加壓縮力的示意圖；（b）火山圖展示GSE210827數據集中的基因表達譜；（c）前25條基因本體（GO）富集分析通路；（d）大鼠正畸牙齒移動（OTM）模型構建示意圖；（e）大鼠牙周組織的TUNEL和CD68雙重熒光染色（比例尺=50μm）；（f）大鼠牙周組織中IL-1β的免疫組化染色（DE：牙本質，PDL：牙周韌帶，AB：牙槽骨，比例尺=50μm）；（g）力學模型和胞葬作用模型示意圖；（h）熒光圖像顯示巨噬細胞胞葬作用（橙色熒光表示用DAPI標記的凋亡細胞，綠色熒光表示用CellMask標記的巨噬細胞膜，比例尺=10μm）；（i）流式細胞術分析和定量描述巨噬細胞胞葬作用（n=3，凋亡細胞用Calcein AM標記，巨噬細胞用DiD標記）；（j）qPCR分析炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α（n=3，VU533是一種特異性胞葬作用增強劑）；（k）ELISA分析炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α（n=3）

（2）機械力擾亂巨噬細胞精氨酸代謝并引發(fā)限制TCA循環(huán)的級聯(lián)反應

生物信息學分析發(fā)現，加載肢體骨樣本中葡萄糖、氨基酸和細胞呼吸等代謝通路顯著富集（圖1c），且與凋亡和炎癥免疫通路密切相關，其中一氧化氮生物合成過程關聯(lián)最為顯著，由精氨酸代謝調控（圖2a）。Q300代謝組學分析顯示，機械力誘導巨噬細胞中88種代謝物顯著變化，精氨酸和脯氨酸代謝以及TCA循環(huán)通路顯著富集（圖2b）。差異代謝物熱圖分析支持這一發(fā)現（圖2c,d），精氨酸代謝通路中精氨酸和天冬氨酸減少，瓜氨酸上調，鳥氨酸和脯氨酸變化不明顯（圖2e），TCA循環(huán)相關代謝物表達受抑制（圖2f）。機械力下調Arg1、上調iNOS，增加NO釋放，同時下調ASS1和ASL（圖2g-i），導致精氨酸耗竭（圖2j）。圖2k總結發(fā)現，精氨酸代謝與TCA循環(huán)存在交叉點，機械力抑制精氨酸生物合成導致富馬酸減少，引發(fā)限制TCA循環(huán)的級聯(lián)反應，最終導致巨噬細胞能量代謝異常。

圖2 機械力擾亂巨噬細胞中的精氨酸代謝并限制三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）。（a）基于GSE210827數據集的富集通路相互作用網絡分析；（b）基于代謝組學測試的hsa數據庫的通路分析氣泡圖；（c，d）與精氨酸和脯氨酸代謝以及能量代謝相關的差異代謝物的熱圖；（e，f）精氨酸代謝和TCA循環(huán)相關代謝物的絕對定量分析（n=5）；（g-j）qPCR和Western blot分析關鍵酶iNOS和Arg1（介導精氨酸消耗）、ASS1和ASL（介導精氨酸合成）；（k）機械力誘導精氨酸代謝紊亂并限制TCA循環(huán)的機制示意圖

（3）L-精氨酸通過恢復巨噬細胞能量代謝改善機械力誘導的胞葬功能障礙和無菌性炎癥

研究人員通過補充L-精氨酸來恢復機械力作用下巨噬細胞的精氨酸儲備（圖3a）。透射電鏡觀察顯示，機械力使巨噬細胞線粒體萎縮變形，而L-精氨酸可部分恢復其形態(tài)（圖3b）。機械力作用下，巨噬細胞內總ROS和線粒體ROS水平顯著增加，線粒體膜電位去極化，而L-精氨酸可部分緩解這些現象（圖3c-e）。機械力作用下巨噬細胞ATP水平降低，NAD+/NADH表達下調，氧含量降低，而L-精氨酸可逆轉這些缺陷（圖3f-h）。共聚焦熒光顯微鏡和流式細胞術分析顯示，L-精氨酸可減輕機械力對胞葬作用的負面影響（圖3i,j），且顯著改善炎癥因子的釋放水平（圖3k）。這些結果表明，恢復巨噬細胞內精氨酸代謝平衡可緩解機械力引發(fā)的能量危機，促進無菌性炎癥消退。

圖3 L-精氨酸通過恢復巨噬細胞能量代謝改善機械力誘導的胞葬作用障礙和無菌性炎癥。（a）控制組、力組和力+L-精氨酸組巨噬細胞中精氨酸水平的分析；（b）透射電子顯微鏡圖像顯示巨噬細胞線粒體的形態(tài)（比例尺=400 nm）；（c）巨噬細胞中活性氧（ROS）水平的分析（DCFH-DA的綠色熒光強度代表細胞內總ROS水平，Mito-SOX的紅色熒光強度代表線粒體ROS水平，比例尺=40μm）；（d，e）線粒體膜電位的分析（JC-1染色的紅綠熒光強度比和TMRM陽性細胞比例反映線粒體膜電位的高低，比例尺=40μm）；（f）巨噬細胞內ATP水平的分析；（g）巨噬細胞內NAD?和NADH水平的分析；（h）巨噬細胞內氧含量的分析（Ru(dpp)?Cl?的紅色熒光越強，氧水平越低，比例尺=80μm）；（i，j）熒光圖像和流式細胞術分析描述巨噬細胞胞葬作用（比例尺=10μm）；（k）ELISA分析在凋亡細胞積累環(huán)境中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平；（l）機械力通過破壞巨噬細胞能量代謝損傷胞葬作用并激活炎癥的機制示意圖

（4）MSN-LA@HA微針的合成與表征

研究人員開發(fā)了一種結合藥物釋放納米顆粒和可溶性微針優(yōu)勢的局部給藥系統(tǒng)，用于機械力條件下L-精氨酸的高效局部遞送。他們合成了由介孔二氧化硅納米顆粒（MSN）和L-精氨酸組成的MSN-LA納米系統(tǒng)（圖4a），并通過高分辨透射電鏡圖像（圖4b）、能譜（EDS）分析（圖4b）、尺寸和Zeta電位測量（圖4c）、BJH法（圖4d）和FTIR結果（圖4e）證實了L-精氨酸的成功封裝。此外，研究人員制備了負載MSN-LA的HA微針（MSN-LA@HA MNs）（圖4f），并通過掃描電鏡和EDS mapping（圖4h）驗證了MSN-LA的成功整合。CCK-8實驗和活-死細胞染色顯示該微針無顯著細胞毒性（圖4i），壓縮測試表明其具有優(yōu)異的機械強度（圖4j），且L-精氨酸的釋放動力學顯示其在前12小時內快速釋放約70%的藥物，剩余藥物隨時間逐漸釋放（圖4k）。

圖4 MSN-LA@HA MNs的合成與表征。（a）MSN-LA合成示意圖；（b）MSN和MSN-LA的透射電子顯微鏡圖像和能量色散光譜（EDS）元素分析；（c）MSN和MSN-LA的粒徑和zeta電位分析；（d）MSN和MSN-LA的孔徑分析；（e）LA、MSN和MSN-LA的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析；（f）MSN-LA@MNs制備過程示意圖；（g）HA MNs和MSN-LA@HA MNs的立體顯微鏡圖像；（h）HA MNs和MSN-LA@HA MNs的掃描電子顯微鏡圖像和EDS元素分析；（i）巨噬細胞與HA、MSN@HA和MSN-LA@HA共培養(yǎng)的CCK-8活性分析；（j）HA MNs和MSN-LA@HA MNs的機械強度分析；（k）MSN-LA@HA MNs的體外釋放動力學

（5）MSN-LA納米馬達的運動能力和趨化特性評估

研究人員通過定量分析發(fā)現，在機械力作用巨噬細胞環(huán)境中，MSN-LA表現出顯著增強擴散特征，其MSD曲線呈拋物線形，運動速度顯著高于MSN（圖5b-e），表明其作為納米馬達的自主運動能力。Y型通道實驗顯示，MSN-LA納米馬達在機械力作用巨噬細胞環(huán)境中逐漸累積（圖5f-h）。Transwell實驗進一步證實了MSN-LA對iNOS的趨化響應，且iNOS抑制劑預處理可降低其趨化能力（圖5i-j）。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現，MSN-LA比MSN具有更強的巨噬細胞內化能力（圖5k）、溶酶體逃逸能力（圖5l）和線粒體共定位程度（圖5m），這有利于其在細胞內發(fā)揮代謝調控功能。

圖5 MSN-LA納米馬達的運動性和趨化特性評估。（a）不同樣品與力載巨噬細胞共孵育時的NO產生；（b，c）MSN（b）和MSN-LA（c）在力載巨噬細胞環(huán)境中的歸一化運動軌跡；（d）基于運動軌跡的均方位移（MSD）擬合分析；（e）MSN和MSN-LA在力載巨噬細胞環(huán)境中的速度；（f）Y形通道示意圖，其中（i）為含有羅丹明B標記的MSN-LA的儲液池，（ii）為含有巨噬細胞裂解液的瓊脂糖凝膠儲液池，（iii）為含有力載巨噬細胞裂解液的瓊脂糖凝膠儲液池；（g，h）Y形通道中MSN-LA的熒光圖像（g）和相應的熒光定量結果（h）；（i）Transwell模型用于垂直趨化實驗的示意圖；（j）高細胞密度腔室的熒光強度曲線；（k）細胞攝取納米顆粒的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像（紅色：納米顆粒）；（l）納米顆粒與溶酶體共定位的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像及Pearson相關系數分析（紅色：納米顆粒，綠色：溶酶體）；（m）納米顆粒與線粒體共定位的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像及Pearson相關系數分析（紅色：納米顆粒，綠色：線粒體）

（6）MSN-LA@MNs增強OTM中的巨噬細胞胞葬作用并促進牙齒移動

研究人員在大鼠OTM過程中分別給予MSN-LA@MNs和MSN@MNs（圖6a，b）。Micro-CT成像和分析顯示，MSN-LA@MNs顯著增加了OTM距離，而MSN@MNs無此效果（圖6c-d）。H&E染色顯示兩組均未出現牙根吸收，壓力側可見骨吸收陷窩（圖6e）。TUNEL和CD68雙熒光染色結果顯示，機械力作用下TUNEL+凋亡細胞從第1天到第7天逐漸增加，而MSN-LA@MNs顯著降低了第3天和第7天的凋亡細胞數量（圖6f-g）。此外，MSN-LA@MNs在第3天和第7天顯著提高了Mφ-associated ACs與total ACs的比值（圖6h），表明巨噬細胞胞葬作用增強。

圖6 MSN-LA@MNs增強正畸牙齒移動中的巨噬細胞胞葬作用并促進牙齒移動。（a，b）在大鼠正畸牙齒移動模型中應用微針的示意圖（a）和實際應用（b，比例尺=2000μm）；（c）第7天大鼠上頜骨的重建微CT圖像（比例尺=1000μm）；（d）第7天牙齒移動距離的分析（n=6）；（e）第一磨牙壓力側組織的蘇木精-伊紅（H&E）染色圖像（黑色箭頭：骨吸收陷窩，DE：牙本質，PDL：牙周韌帶，AB：牙槽骨，比例尺=200μm）；（f）第1、3和7天大鼠第一磨牙壓力側的TUNEL和CD68雙重熒光染色（比例尺=50μm）；（g）TUNEL陽性凋亡細胞的半定量熒光分析（n=5）；（h）TUNEL和CD68雙陽性細胞的分析，表征巨噬細胞胞葬作用（n=5）

（7）MSN-LA@MNs在iNOS趨化引導下時序調節(jié)OTM中的無菌性炎癥

研究人員分析了MSN-LA@MNs對大鼠OTM模型中無菌性炎癥的調控作用。免疫組化染色和半定量分析顯示，MSN-LA@MNs組在OTM初期（第1天）顯著升高IL-1β水平，第3天維持較高表達，而在第7天較機械力組明顯降低（圖7a，c）。CD68和iNOS雙熒光染色及半定量分析顯示，CD68和iNOS雙陽性表達趨勢與IL-1β相似（圖7b，d）。這些結果表明，MSN-LA@MNs在OTM初期短暫升高炎癥水平，隨后在線性期更徹底地消退炎癥，促進組織修復。圖7e展示了MSN-LA@MNs對OTM無菌性炎癥的時序調控作用。

圖7 MSN-LA@MNs在iNOS的趨化引導下以時間順序調節(jié)正畸牙齒移動中的無菌性炎癥。（a）大鼠牙周組織中IL-1β的免疫組化染色（DE：牙本質，PDL：牙周韌帶，AB：牙槽骨，比例尺=50μm）；（b）第1、3和7天大鼠第一磨牙壓力側的iNOS和CD68雙重熒光染色（比例尺=50μm）；（c）IL-1β陽性區(qū)域百分比的半定量分析（n=6）；（d）iNOS和CD68雙陽性細胞的熒光半定量分析（n=5，與力組作為對照進行統(tǒng)計比較）；（e）MSN-LA@MNs在iNOS的趨化引導下以時間順序調節(jié)正畸牙齒移動中無菌性炎癥的示意圖