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針對上述問題，中國科學院大學王育才教授團隊提出了一種體內產生耐受性抗原呈遞細胞（tol-APCs）的新方法，專門針對自身免疫性疾病中激活的T細胞。該方法通過低免疫原性的mRNA遞送在APCs上產生負共刺激分子。與激活APCs的傳統(tǒng)脂質納米顆粒（LNPs）不同，這些專用LNPs旨在最小化免疫原性。通過實驗設計（DOE）方法優(yōu)化了LNPs的N/P比和組成，以降低免疫原性。研究將編碼關鍵負共刺激信號的PDL1 mRNA封裝到這些專用LNPs中，稱為LNPs/mPDL1。皮下注射后，LNPs/mPDL1被APCs優(yōu)先攝取，從而在體內產生PDL1+的tol-APCs。這些tol-APCs通過PDL1/PD1途徑特異性靶向過度激活的T細胞，同時保留未激活的T細胞，從而提高治療的安全性。在類風濕關節(jié)炎和潰瘍性結腸炎的小鼠模型中，該方法不僅抑制了T細胞的過度活化，還誘導了調節(jié)性T細胞的擴增，減少了炎癥，并顯著減緩了疾病進展。該文章于2025年3月28日以《Generation of tolerogenic antigen-presenting cells in vivo via the delivery of mRNA encoding PDL1 within lipid nanoparticles》為題發(fā)表于《Nature Biomedical Engineering》（DOI：10.1038/s41551-025-01373-0）。

圖1：LNPs/mPDL1在體內產生的耐受性抗原呈遞細胞（tol-APCs）用于治療自身免疫性疾?。ˋIDs）。（A）LNPs/mPDL1在體內產生tol-APCs的概念示意圖；（B）tol-APCs緩解AIDs的機制：減少TH1和TH17細胞，增加Treg細胞，誘導激活T細胞凋亡，選擇性靶向激活T細胞

（1）使用DOE優(yōu)化低免疫原性的LNP

在治療自身免疫性疾?。ˋIDs）時，目前用于mRNA疫苗佐劑的脂質納米顆粒（LNP）配方可能上調抗原呈遞細胞（APCs）上共刺激分子（如CD80、CD86和CD40）的表達，從而引發(fā)非預期的免疫反應。為開發(fā)低免疫原性的LNP配方用于AIDs的mRNA治療，研究者系統(tǒng)調整了LNP配方中四種成分（SM-102、DSPC、DMG-PEG2000和膽固醇）的摩爾比例及N/P比值。以Moderna新冠mRNA疫苗的LNP配方（A0）為參考，通過Taguchi OA設計創(chuàng)建了包含9種配方的庫A，包裹增強型綠色熒光蛋白（EGFP）mRNA作為報告基因。在小鼠皮下注射后，評估了這些配方的免疫原性（圖2a、b）。結果顯示，LNP的組成和N/P比值顯著影響轉染效率和免疫原性，體現(xiàn)在樹突狀細胞（DCs）上EGFP和共刺激分子CD80、CD86、CD40的表達水平差異（圖2c–e），且N/P比值與LNP免疫原性之間存在顯著相關性。配方A7（SM-102：DSPC：DMG-PEG：膽固醇 = 25:5:0.5:69.5；N/P = 4）在淋巴結中總DCs和EGFP+ DCs上共刺激分子的表達水平最低（圖2c–f）?；贏7的進一步優(yōu)化產生了庫B，數(shù)據顯示A7在庫B配方中總DCs和EGFP+ DCs上共刺激分子的表達最低（圖2h–k）。因此，A7被選為用于AIDs體內研究的最優(yōu)LNP配方。

圖2：使用實驗設計（DOE）優(yōu)化低免疫原性LNP配方。（A）篩選低免疫原性LNP配方的體內實驗流程；（B）A庫配方參數(shù)；（C–E）A庫配方處理后DCs表面CD80、CD86和CD40的流式細胞術分析；（F）EGFP+ DCs表面CD80的流式細胞術分析；（G）B庫配方參數(shù)；（H–J）B庫配方處理后DCs表面CD80、CD86和CD40的流式細胞術分析；（K）EGFP+ DCs表面CD80的流式細胞術分析

（2）LNPs/mPDL1 治療在體外和體內產生 tol-APC

A7配方的脂質納米顆粒（LNP）被用于包裹編碼PDL1的mRNA，制備了LNPs/mPDL1。PDL1 mRNA經體外轉錄、密碼子優(yōu)化、帽子修飾及尿苷替換為N1-甲基偽尿苷，LNPs/mPDL1的平均粒徑為173 nm，zeta電位為12.9 mV。實驗發(fā)現(xiàn)，經LNPs/mPDL1處理24小時的DC2.4和RAW264.7細胞，PDL1表達顯著高于經空LNPs或PBS處理的細胞，表明其可有效將APCs轉化為tol-APCs（圖3a–d）。小鼠皮下注射LNPs/mPDL1后，淋巴結中CD11c+和CD11b+細胞表面PDL1表達較高，而CD11b? CD11c?細胞表面PDL1表達較低（圖3f、g）。脾臟和外周血中觀察到類似結果，但骨髓中未產生tol-APCs，且誘導的tol-APCs至少維持4天（圖3h、i）。LNPs/mPDL1處理對共刺激分子表達的影響顯示，淋巴結中總APCs上CD80表達略有增加，CD86和CD40表達降低；PDL1+ tol-APCs上CD80和CD86表達增加，CD40表達降低。脾臟中這些分子在總APCs上表達適度增加，但在PDL1+ tol-APCs上無變化或降低，外周血中各APC群體未觀察到變化。結果表明，LNPs/mPDL1可在體內高效生成tol-APCs，且主要影響APCs，對非APC免疫細胞影響極小。

圖3：LNPs/mPDL1處理產生的tol-APCs。（A，B）LNPs/mPDL1處理后DC2.4細胞和RAW264.7細胞的PDL1表達（共聚焦顯微鏡圖像及定量分析）；（C，D）流式細胞術分析DC2.4細胞和RAW264.7細胞表面PDL1表達；（E）LNPs/mPDL1在體內產生PDL1+ APCs的示意圖；（F，G）LNPs/mPDL1處理后腹股溝淋巴結中CD11c+和CD11b+細胞表面PDL1的流式細胞術分析；（H）LNPs/mPDL1在C57BL/6小鼠中的給藥時間表；（I）LNPs/mPDL1處理后腹股溝淋巴結中CD11c+和CD11b+細胞表面PDL1的流式細胞術分析

（3）PDL1⁺tol-APCs在體外選擇性降低活化T細胞

PD1在激活的T細胞上表達水平較高，而在幼稚T細胞上表達較低，對防止T細胞過度激活和促進免疫耐受起關鍵作用（圖4a、b）。體外實驗中，用CD3/CD28激動劑抗體（αCD3/CD28）刺激的T細胞PD1表達水平更高，模擬了體內T細胞的激活狀態(tài)。為探究由LNPs/mPDL1產生的tol-APCs是否能抑制T細胞反應，將激活的T細胞用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（CFSE）標記后，與通過LNPs/mPDL1處理生成的PDL1+ tol-DCs共培養(yǎng)（圖4a）。48小時后，觀察到CD4+和CD8+ T細胞的增殖顯著減少（圖4c）。此外，PDL1作為程序性死亡配體，與激活T細胞上的PD1結合可誘導凋亡。因此，研究了由LNPs/mPDL1產生的tol-APCs是否能選擇性地促進過度激活的T細胞凋亡。將經PBS、LNPs或LNPs/mPDL1處理的DCs與刺激或未刺激的T細胞共培養(yǎng)12小時（圖4d）。結果顯示，由LNPs/mPDL1產生的tol-APCs顯著促進了刺激T細胞的凋亡，但對未刺激T細胞無影響（圖4e、f）。這一效應通過刺激T細胞中增強的caspase-3/7活性得到進一步證實。

圖4：LNPs/mPDL1產生的tol-APCs在體外抑制激活T細胞的增殖并誘導其凋亡。（A）T細胞增殖實驗方案；（B）刺激和未刺激T細胞上PD1的表達；（C）CFSE標記的刺激T細胞的增殖；（D）T細胞死亡實驗方案；（E，F(xiàn)）Annexin V/PI染色分析刺激和未刺激T細胞的凋亡和壞死比例

（4）PDL1⁺tol-APC 選擇性降低體內活化的 T 細胞

通過過繼細胞轉移實驗進一步探究了LNPs/mPDL1在體內產生的tol-APCs是否能選擇性減少激活的T細胞。實驗使用BALB/c裸鼠以減少宿主免疫系統(tǒng)對轉移細胞的清除。小鼠皮下注射PBS、LNPs或LNPs/mPDL1。從BALB/c小鼠脾臟中分離T細胞，用αCD3/CD28激活并標記不同濃度的CFSE，其中未刺激T細胞（未用αCD3/CD28處理）CFSE水平低，刺激T細胞CFSE水平高。兩種T細胞按1:1比例混合后，在LNPs/mPDL1注射24小時后過繼轉移至BALB/c裸鼠（圖5a）。流式細胞術分析證實了受體小鼠體內有效生成了tol-DCs（圖5b）。經LNPs/mPDL1處理的小鼠中，刺激T細胞的比例顯著降低（圖5c）。對于轉移的T細胞，LNPs/mPDL1處理小鼠中刺激T細胞在總轉移T細胞中的比例以及刺激T細胞與未刺激T細胞的比值均顯著低于對照組（圖5d、e）。具體而言，LNPs/mPDL1在體內選擇性減少了轉移的激活CD4+和CD8+ T細胞，降低了小鼠脾臟中激活與未激活CD4+和CD8+ T細胞的比值，同時增加了未激活T細胞的比例（圖5f、g）。這些結果表明，皮下注射LNPs/mPDL1可選擇性減少過度激活的T細胞，對幼稚T細胞影響極小，突顯了該方法的治療安全性（圖5h）。

圖5：LNPs/mPDL1處理在體內產生的tol-APCs選擇性減少激活的T細胞。（A）T細胞過繼轉移實驗示意圖；（B）CD11c+細胞表面PDL1的表達；（C）轉移的刺激T細胞在總脾細胞中的比例；（D）轉移T細胞的定量分析；（E）轉移的刺激T細胞與未刺激T細胞的比例；（F）轉移的刺激CD4+ T細胞在總轉移CD4+ T細胞中的比例；（G）轉移的刺激CD8+ T細胞在總轉移CD8+ T細胞中的比例；（H）tol-APCs選擇性靶向激活T細胞的示意圖

（6）體內產生的tol-APC可改善小鼠的RA進展

在類風濕性關節(jié)炎（RA）小鼠模型中評估了LNPs/mPDL1的治療潛力。DBA/1小鼠在第0天和第21天用II型膠原免疫建立RA模型。第28天，小鼠分為4組：未處理對照組、LNPs組、LNPs/mPDL1組和依那西普（iTNF-α）組，各組分別在第28天、第32天、第36天和第40天接受處理，并在第42天前每隔一天評估關節(jié)炎指數(shù)（圖6a）。結果顯示，LNPs/mPDL1在RA模型小鼠中有效生成了tol-APCs（補充圖21），顯著延緩了疾病進展，關節(jié)腫脹和炎癥反應得到緩解，效果與iTNF-α相當（圖6b–d）。第42天，后膝關節(jié)Safranin O/fast green（SO/FG）染色顯示LNPs/mPDL1和iTNF-α組小鼠軟骨厚度顯著增加（圖6e、g及擴展數(shù)據圖1a）。免疫組化（IHC）染色證實，治療后關節(jié)中IFN-γ和TNF-α等炎癥因子減少（圖6f、g及擴展數(shù)據圖1b、c）。LNPs/mPDL1處理的小鼠后膝關節(jié)中CD8+ T細胞和CD4+ T細胞浸潤顯著減少，Treg細胞增加（擴展數(shù)據圖1d–g）。流式細胞術分析顯示，LNPs/mPDL1處理后，淋巴結中產生促炎細胞因子IL-17A、TNF-α或IFN-γ的CD4+ T細胞顯著減少，而Treg細胞增加（補充圖22和23），且LNPs/mPDL1在減少促炎性CD4+ T細胞方面比iTNF-α更有效。此外，LNPs/mPDL1處理后，RA小鼠脾臟、腋窩和腹股溝淋巴結以及血液中的循環(huán)效應T（Teff）細胞顯著減少（補充圖24和25）。綜上所述，LNPs/mPDL1治療可有效緩解RA癥狀。

圖6：LNPs/mPDL1在體內產生的tol-APCs抑制類風濕性關節(jié)炎（RA）的進展。（A）RA誘導及治療方案；（B）RA小鼠隨時間變化的平均關節(jié)炎指數(shù)；（C）RA小鼠的腳跟墊典型圖像；（D）RA小鼠隨時間變化的爪子厚度；（E，F(xiàn)）關節(jié)切片的SO/FG染色和IFN-γ、TNF-α染色圖像；（G）tol-APCs在RA關節(jié)中減少炎癥細胞和細胞因子的示意圖

（7）體內產生的tol-APC可緩解DSS誘發(fā)的小鼠的UC

在DSS誘導的潰瘍性結腸炎（UC）小鼠模型中，C57BL/6小鼠隨機分為4組，第0–7天飲用3% DSS水，第1、3、5天分別接受PBS、LNPs、LNPs/mPDL1和環(huán)孢素處理（圖7a）。健康小鼠作為對照。結果顯示，LNPs/mPDL1在UC模型小鼠中有效誘導tol-APCs，顯著降低DAI評分（圖7b、c，補充圖26），減輕體重下降（圖7d），恢復結腸長度（圖7e、f），結腸長度從PBS處理的5.6 cm恢復至6.6 cm。組織學分析顯示LNPs/mPDL1緩解了UC小鼠的壞死細胞、黏膜損傷和腺窩結構破壞（圖7g），治療效果與環(huán)孢素相當。IHC染色顯示LNPs/mPDL1顯著減少CD4+和CD8+ T細胞浸潤，增加Treg細胞水平，降低腸道炎癥部位TNF-α水平（圖7h，擴展數(shù)據圖2）。流式細胞術分析顯示，LNPs/mPDL1處理后，與環(huán)孢素等其他組相比，TH17細胞減少，Treg細胞增加（圖7i，補充圖27）。此外，LNPs/mPDL1顯著減少腸系膜和腹股溝淋巴結、脾臟和血液中的效應T（Teff）細胞（補充圖28）。綜上所述，LNPs/mPDL1在緩解DSS誘導的結腸炎方面表現(xiàn)出有效性。

圖7：LNPs/mPDL1在體內產生的tol-APCs在DSS誘導的潰瘍性結腸炎（UC）小鼠中發(fā)揮治療作用。（A）UC誘導及治療方案；（B）疾病進展的DAI評分；（C）第7天的DAI評分；（D）體重變化；（E，F(xiàn)）小鼠結腸圖像及長度；（G）結腸切片的H&E染色及組織學評分；（H）CD4免疫組化染色及CD4+細胞數(shù)量分析；（I）腸系膜淋巴結中CD4+ T細胞的IL-17A表達分析