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研究背景：

慢性牙周炎是一種由細(xì)菌引起的炎癥性疾病，導(dǎo)致牙槽骨逐步吸收。在感染過程中，牙菌斑微生物破壞牙周穩(wěn)態(tài)，異常的宿主-細(xì)菌相互作用引發(fā)持續(xù)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致骨質(zhì)流失。巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有助于病原體的清除，但同時(shí)產(chǎn)生的活性氧（ROS）和促炎細(xì)胞因子會(huì)加劇組織破壞。研究表明ROS和牙齦卟啉單胞菌等病原體通過經(jīng)典或非經(jīng)典途徑激活巨噬細(xì)胞NLRP3，不僅增加破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收和核因子κB（NF-κB）通路的刺激，而且還損害間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力。靶向抑制巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活為牙周炎的治療提供了一種獨(dú)特的方法。

針對上述問題，中山大學(xué)口腔醫(yī)院譚家莉主任醫(yī)師團(tuán)隊(duì)提出一種新型雙交聯(lián)水凝膠體系pGM/cPL@NI，該體系具有較高的機(jī)械強(qiáng)度和多功能性，可以滿足牙周炎治療的各種需求。通過用苯硼酸（PBA）和鄰苯二酚分別對明膠甲基丙烯酰（GelMA）和ε-聚賴氨酸（ε-PL）進(jìn)行功能化修飾，通過動(dòng)態(tài)硼酸酯鍵和輻照下光誘導(dǎo)交聯(lián)的結(jié)合，形成負(fù)載MCC950的pGM/cPL@NI。利用ε-PL和鄰苯二酚的固有特性，實(shí)現(xiàn)良好的抗菌和抗氧化性能。在ROS和酸性環(huán)境下，pGM/cPL@NI響應(yīng)性地釋放MCC950并抑制巨噬細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體活化，從而減弱促炎極化和細(xì)胞因子級聯(lián)。相關(guān)研究在2024年2月5日以“Multifunctionalized and Dual-Crosslinked Hydrogel Promotes Inflammation Resolution and Bone Regeneration via NLRP3 Inhibition in Periodontitis”為題發(fā)表于《Small Structures》（DOI：10.1002/sstr.202300281）上。 

圖1 多功能雙交聯(lián)pGM/cPL@NI水凝膠通過免疫調(diào)節(jié)促進(jìn)牙周骨再生的機(jī)制示意圖

（1）可注射雙交聯(lián)響應(yīng)水凝膠的表征

該研究團(tuán)隊(duì)將PBA和兒茶酚基團(tuán)分別接枝到明膠和ε-PL上，生成GelMA-PBA（pGM）和ε-PL-cat（cPL）（圖2A）。通過GelMA-PBA和ε-PL-cat兩步交聯(lián)。第一重交聯(lián)為動(dòng)態(tài)硼酸酯鍵，能夠響應(yīng)ROS和酸性環(huán)境斷裂。第二重交聯(lián)為碳碳雙鍵，光交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)保持穩(wěn)定并有效釋放嵌入的藥物，而不會(huì)快速破壞水凝膠結(jié)構(gòu)。在中性緩沖環(huán)境中，pGM/cPL水凝膠的降解速度慢于GelMA。然而，在酸性或富含ROS的環(huán)境中，pGM/cPL的降解速度明顯加快，且呈H₂O₂濃度依賴性，進(jìn)一步證實(shí)了其刺激響應(yīng)性。此外，負(fù)載MCC950后，pGM/cPL@NI的藥物釋放行為與上述結(jié)果一致（圖2K），模型藥物羅丹明B在正常環(huán)境下40d內(nèi)表現(xiàn)出緩釋行為。然而，當(dāng)pH為5.5或存在0.1和1 mm H₂O₂時(shí)，釋放速度在2天內(nèi)顯著加快。 

圖2 水凝膠的合成與表征

（2）雙交聯(lián)水凝膠的生物相容性和抗菌性能

原代大鼠骨髓干細(xì)胞（rBMSCs）和鼠成纖維細(xì)胞（L929）活/死染色表明與pGM/cPL和pGM/cPL@NI共培養(yǎng)后細(xì)胞活力良好，并且與GelMA水凝膠相比，在培養(yǎng)7天后更能促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和細(xì)胞內(nèi)連接。水凝膠溶血率均低于5%，足以支持長期體內(nèi)使用。與水凝膠培養(yǎng)后的大腸桿菌（E. coli）和牙齦卟啉單胞菌（P. gingivalis）的存活率?分別不到15%和2%（圖3G）。E. coli的生長在2小時(shí)后受到顯著抑制，而P. gingivalis在6小時(shí)后也呈現(xiàn)出類似的模式。細(xì)菌掃描電子顯微鏡結(jié)果表明，細(xì)菌表現(xiàn)出形狀不規(guī)則、膜收縮或破裂的現(xiàn)象。其抗菌機(jī)制主要?dú)w因于陽離子誘導(dǎo)的ε-PL細(xì)胞/壁膜裂解，兒茶酚中的多巴胺殘基通過自氧化協(xié)同殺死微生物。 

圖3 水凝膠的體外生物相容性和抗菌性能

（3）pGM/cPL@NI有效減弱P. gingivalis誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化和巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生

MCC950以濃度依賴性方式抑制P. gingivalis-LPS/Nigericin刺激后細(xì)胞外IL-1β的表達(dá)水平。NLRP3炎癥小體的激活介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，膜通透性增加，乳酸脫氫酶（LDH）釋放到細(xì)胞外。pGM/cPL和pGM/cPL@NI水凝膠處理后細(xì)胞膜的活力和通透性大大恢復(fù)，感染P. gingivalis的BMDM因膜破裂而逐漸分泌LDH；pGM/cPL和pGM/cPL@NI水凝膠在4小時(shí)內(nèi)顯著降低了LDH釋放的增加。經(jīng)pGM/cPL@NI水凝膠處理后，Nlrp3、Caspase1和Gsdmd的表達(dá)均呈明顯下降趨勢，pGM/cPL和pGM/cPL@NI之間存在顯著差異。水凝膠處理后促炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-18和TNF-α）的分泌量顯著減少。 

圖4 pGM/cPL@NI體外通過釋放MCC950抑制NLRP3炎癥小體活化

（4）pGM/cPL@NI體外清除細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激并促進(jìn)抗炎巨噬細(xì)胞極化

由于ε-PL上兒茶酚的修飾，酚羥基成為ROS的最佳氫或電子供體，有效清除高濃度的ROS。將細(xì)胞與pGM/cPL或pGM/cPL@NI共培養(yǎng)后，DCF的熒光強(qiáng)度明顯降低。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，經(jīng)pGM/cPL和pGM/cPL@NI處理后，ROS表達(dá)下降約50%。與對照組相比，P. gingivalis -LPS誘導(dǎo)的炎癥顯著降低了線粒體膜電位，單體/聚集體比例提高了24.59±4.33倍。相反，pGM/cPL和pGM/cPL@NI恢復(fù)了膜電位，并且存在更多的JC-1聚集體。通過將BMDM與pGM/cPL和pGM/cPL@NI共培養(yǎng)，能夠顯著降低P. gingivalis-LPS對M2極化的抑制作用，并促使細(xì)胞從M0型極化為M2型。 

圖5 體外評估水凝膠在 ROS 清除和巨噬細(xì)胞極化調(diào)節(jié)中的活性

（5）pGM/cPL@NI促進(jìn)rBMSCs體外成骨分化

堿性磷酸酶（ALP）染色和茜素紅S（ARS）染色結(jié)果顯示pGM/cPL和pGM/cPL@NI組的基質(zhì)礦化均顯著增加，顯示出更優(yōu)異的成骨效果。雖然P. gingivalis -LPS誘導(dǎo)后rBMSCs的成骨潛能減弱，但通過pGM/cPL和pGM/cPL@NI處理細(xì)胞后，炎癥條件下成骨作用得到了改善。與P. gingivalis -LPS組相比，pGM/cPL和pGM/cPL@NI組的成骨相關(guān)基因（Runx2、Alp、Ocn和Osx）的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（p ?< 0.05）。當(dāng)不存在P. gingivalis -LPS時(shí)，pGM/cPL和pGM/cPL@NI水凝膠均顯著增加Runx2和OCN的表達(dá)。P. gingivalis -LPS 顯著降低成骨作用，隨后通過水凝膠干預(yù)成功恢復(fù)。為了確定通過巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)間接控制成骨作用，將rBMSCs與由P. gingivalis -LPS和Nigericin預(yù)先誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基（Mφ-CM）共培養(yǎng)，以模擬NLRP3炎癥小體活化環(huán)境。通過pGM/cPL@NI的免疫調(diào)節(jié)作用，條件培養(yǎng)基顯著增強(qiáng)了rBMSCs的基質(zhì)礦化。pGM/cPL@NI干預(yù)后，qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示RUNX2和OCN上調(diào)，但P. gingivalis -LPS/Nigericin組與pGM/cPL組之間無顯著差異。 

圖6 pGM/cPL和pGM/cPL@NI直接和間接促進(jìn)rBMSCs體外成骨分化

（6）pGM/cPL@NI減少實(shí)驗(yàn)大鼠牙周炎的炎癥性骨質(zhì)流失

采用絲線結(jié)扎聯(lián)合牙齦卟啉單胞菌注射法建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，每3天注射一次水凝膠。在牙周炎誘導(dǎo)4周和水凝膠干預(yù)4周后，micro-CT顯示組間存在明顯差異。絲線結(jié)扎和牙齦卟啉單胞菌感染導(dǎo)致第二磨牙周圍近遠(yuǎn)中部分均出現(xiàn)明顯的骨吸收，甚至達(dá)到根尖1/3。pGM/cPL@NI將CEJ-ABC距離減少至0.43±0.02 mm，比對照組和PBS組減少近50%。Micro-CT分析顯示pGM/cPL和pGM/cPL@NI水凝膠治療的組與對照組和PBS組相比，均使骨量顯著增加。組織學(xué)染色結(jié)果顯示，牙槽骨及連接上皮附著正常，高度正常，但均在牙周炎后出現(xiàn)根尖萎縮，形成深牙周袋，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤和牙間乳頭破壞。水凝膠組牙周狀況明顯改善。Masson三色染色結(jié)果顯示，pGM/cPL和pGM/cPL@NI組牙槽骨新生及膠原沉積增多，與PBS組相比，新骨表面相對光滑、連續(xù)。CD206、IL-1β和Runx2的免疫熒光染色顯示PBS處理后，炎癥因子IL-1β表達(dá)較高，而水凝膠治療后牙周炎癥明顯減輕。同時(shí)，與PBS組相比，熒光標(biāo)記的CD206和Runx2在pGM/cPL和pGM/cPL@NI組中分布廣泛，體現(xiàn)了多功能水凝膠對牙周組織修復(fù)的正向調(diào)控作用。載MCC950的pGM/cPL@NI在調(diào)節(jié)這些標(biāo)志物方面發(fā)揮了優(yōu)異的潛力，在促進(jìn)炎癥消退和骨再生方面有更顯著的改善。 

圖7 pGM/cPL 和 pGM/cPL@NI 促進(jìn)體內(nèi)牙周炎癥消退和骨再生

小結(jié)：

該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種具有雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的多功能藥物輸送水凝膠系統(tǒng)pGM/cPL@NI，該系統(tǒng)結(jié)合了抗菌、ROS清除、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)成骨分化等作用，發(fā)揮了良好的牙槽骨再生作用。動(dòng)態(tài)化學(xué)鍵和光誘導(dǎo)雙重交聯(lián)增強(qiáng)了水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度，并賦予pGM/cPL@NI水凝膠牙周微環(huán)境響應(yīng)釋放NLRP3抑制劑MCC950的能力。通過ε-PL 和兒茶酚的固有特性實(shí)現(xiàn)殺菌和抗氧化作用，無需引入其他物質(zhì)。本研究明確了牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化與牙周炎進(jìn)展之間的相關(guān)性，而pGM/cPL@NI釋放的MCC950可有效阻斷這種相關(guān)性，進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞的抗炎調(diào)節(jié)。

原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/sstr.202300281